ITP究竟是怎样发生的？盘一盘，揪出这个幕后推手！

2020年9月24日-26日，中华医学会第16次全国血液学年会采用“线上+线下”模式召开。血液学年会上，国内外血液领域大咖云集，聚焦血液学研究最新进展。来自山东大学齐鲁医院的彭军教授在会上分享了关于ITP免疫机制进展的专题讲座，本文整理自其演讲内容。 

原发免疫性血小板减少症（Primary Immune Thrombocytopenia，ITP），是一种临床上最为常见的获得性自身免疫性出血性疾病。近几年，关于其发病机制取得了较大进展，让我们跟着彭军教授一起来盘点回顾！

ITP发病机制

免疫失耐受情况下，ITP主要是由血小板破坏增加和血小板生成减少导致的。引起血小板破坏增加的经典破坏方式是在脾脏中被自身抗体所破坏；其次，近年来研究发现血小板糖蛋白也能通过脱糖引起巨噬细胞、肝细胞吞噬；最后是细胞毒性T细胞能直接裂解血小板。血小板生成减少一方面由于巨核细胞正常凋亡异常，导致血小板成熟障碍，另一方面是巨核细胞的副凋亡。

（ITP的发病机制）

机制1：细胞免疫失耐受

Tregs和MDSCs——其实是对难兄难弟

人体中存在多种抑制性免疫细胞，包括调节性T细胞（Treg）亚群，髓源性抑制细胞等。研究发现在ITP患者中Treg细胞亚型发生改变^[1]：活化性及非抑制性的Treg（a-Treg＆n-s·Treg）显著增多，而免疫抑制性Treg（r-Treg）有所下降（图1），而a-Treg水平升高也可做为激素治疗的有效预测因素。

图1 ITP患者及其对照组各Treg细胞亚群所占比例

注：对比NC组，ITP患者a-Treg＆n-s·Treg显著增多，而r-Treg明显下降；组Ⅰ（GroupⅠ）表示CD45RA⁺Foxp3lo免疫抑制性Treg细胞，组Ⅱ（GroupⅡ）表示CD45RA^-Foxp3^hi活化性Treg细胞，组Ⅲ（GroupⅢ）表示CD45RA^-Foxp3^lo非抑制性Treg细胞；NC指正常对照组，ITP指ITP病人组。

其他有趣的科学发现也在近几年受到学界广泛关注，这其中包括了：在ITP患者CD4⁺CD25⁺细胞上发现CD39表达明显降低，其抑制性功能受损，而给予皮质激素治疗后就能够纠正这种异常表现^[2]（图2）；而CD8⁺CD28⁺Treg细胞数量和功能均受到抑制^[3]；ITP患者T细胞中存在脂阀的异常表达，从而影响T细胞信号传导^[4]；对于激素治疗无效的这类ITP患者CD4⁺细胞STAT3磷酸化水平明显低于治疗有效者^[5]；此外，ITP患者中CD16⁺单核细胞亚群的比例是增多^[6]。

图2 ITP患者及其对照组CD4⁺CD25⁺细胞治疗前后数量对比

注：在ITP患者CD4⁺CD25⁺细胞上CD39表达明显降低，给予治疗后能够纠正这种异常表现（图a），并且增加了激素治疗有效患者（R组）的CD4⁺CD25⁺细胞的数量（图b和c）；NC组（n=20），Pre-T指治疗前的ITP患者组（n=23），Post-T指治疗后的ITP患者组，R指反应组（n=16），NR指无反应组（n=7）。

髓系抑制细胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSCs）是另一类免疫抑制细胞，具有强大的抑制功能。彭军课题组发现^[7]：ITP患者外周血及脾脏中的MDSCs显著减少，功能分子Arg-1的表达也明显降低，而诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）表达升高（图3）。通过体外实验，观察到大剂量地塞米松（HD-DXM）可以扩增ITP患者的MDSCs，并提高MDSCs的抑炎因子的表达如IL-10、TGF-β、VEGF。

图3 ITP患者及其对照组MDSCs数目及Arg-1、iNOS表达对比

注：图B为患者及正常人的CD11b⁺CD33⁺HLA-DRlow细胞占全血细胞的比例；图C和D分别表示Arg-1或iNOS在MDSCs上的平均荧光密度；MIF指平均荧光密度。

研究发现在新诊断的ITP患者中，CR组（完全缓解组）患者中MDSCs的比例增加，且与M2样巨噬细胞占比呈现正相关^[8]。得到治疗后CR组患者的MDSCs和M2样巨噬细胞均得到了显著升高，而PR组（部分缓解）及NR组（没有缓解）的MDSCs的数量明显减少，M2样巨噬细胞则略有减少（图4）。

图4 治疗后ITP患者及其对照MDSCs和M2样巨噬细胞数目

注：图c表示治疗前后ITP患者的外周MDSCs的比例有显著性上升；但图d显示治疗前后M2样巨噬细胞并没有明显变化；HC指健康对照组，ITP指ITP患者组，ITO-CR指治疗后ITP患者病情得到完全缓解组，ITP-PR+NR指治疗后ITP患者病情得到部分缓解或没有缓解组。

关于B细胞的研究也得到国内外学者的关注，ITP患者中CD95⁺幼稚B细胞的增加被认为与疾病相关^[9]，自身抗体阳性患者体内的CD21⁺幼稚B细胞群体特征性增多。

小结

1.ITP患者存在Treg细胞亚群改变，脂阀异常影响信号传导，STAT3磷酸化水平变化等，给予激素治疗能纠正其异常的蛋白表达；
2.ITP患者的外周MDSCs显著减少，功能分子Arg-1的表达明显降低，iNOS表达升高，给予HM-DXM能促进MDSCs增殖及抑制功能。

机制2：血小板脱糖   

糖蛋白地位不容小视！

血小板脱糖即血小板去唾液酸化，安徽医科大学附属医院曾清教授与彭军教授课题组均发现糖蛋白GP1b-Ⅸ抗体阳性患者对IVIG（静脉注射免疫球蛋白）和激素治疗的效果不佳。

针对这一现象背后的机制，国外学者指出非Fc依赖性机械分子信号通路所致的ITP，通过机械力的作用导致血小板活化，后被清除，从而引起血小板数量减少，此成果发表在著名杂志Blood^[10]。抗LBD（GP1b-Ⅸ的配体结合域）抗体与GP1b-Ⅸ结合使得2个相反的血小板发生交联，在剪切流作用下，这种交联作用对GP1b-Ⅸ产生拉力并使MSD（GP1b-Ⅸ的机械传感域）展开，从而激活信号通路，导致血小板清除，但如果抗体结合力较弱，如AK2这种交联作用便不稳固（图5）。

图5 血小板激活的非Fc依赖性机械分子信号通路示意图

另一种非Fc依赖性血小板清除的机制是抗GFIba抗体诱导非Fc依赖性血小板激活，NEU-1易位及脱糖，抗GFIba抗体结合的血小板则在肝脏中通Ashwell-Morell受体清除，经唾液酸酶抑制剂处理后，小鼠抗GPIba抗体介导的血小板减少^[11]。

除了GP1b-Ⅸ抗体介导的血小板脱糖，2019年国际血栓与止血年会（ISTH）会议上Jan Ziamal教授也提出：GPⅡb/Ⅲa抗体也能引起血小板脱糖，即便是在MAIPA阴性的ITP患者身上，使用ITP患者的IgG片段洗涤血小板也能引起脱糖，阻断了FcyRⅡa可减少此情况下的血小板的脱糖。紧接着通过体内实验，将人的血小板打入非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，发现使用唾液酸酶抑制剂后，血小板的生存情况有了明显改善，这说明GPⅡb/Ⅲa抗体介导的血小板清除至少部分依赖于脱糖。

脱糖对血小板的影响显著，不仅会影响血小板的数目和功能（纤维蛋白原粘附导致聚合），并且能引起巨核细胞的脱糖，其脱糖后将抑制前体血小板的形成，进一步加剧血小板的下降。

血小板的脱糖水平也被翟志明教授证实与疾病有密切的联系^[12]。激素治疗前，血小板的脱糖水平较高，治疗后，水平明显降低，同时GP1b-Ⅸ抗体阳性患者的脱糖水平较高。

小结

1，ITP患者中抗体介导的反应能导致血小板及巨核细胞脱糖；
2，脱糖作用不限于GP1b-Ⅸ抗体，还包括GPⅡb/Ⅲa抗体，后者通过FcyRⅡa介导此过程。
3，抗体介导的脱糖导致ITP血小板被清除
4，体外实验中，唾液酸减少将导致前血小板生成受阻。

机制3：血小板凋亡

“与众不同”的凋亡之路：Akt信号通路

抗GPIba抗体诱导Akt信号通路激活，致使血小板凋亡，但其机制与血小板的激活无关，而是与PKA激酶的活化有关^[13]，最终，与抗GPIba抗体结合的血小板表面磷脂酰丝氨酸（PS）过表达，使其在肝脏中被吞噬清除，这一过程是非Fc依赖的。

图6 抗GPIba抗体诱导Akt信号通路导致血小板凋亡示意图

PKA作为血小板细胞凋亡的稳态调节因子，能决定血小板寿命和存活，调节PKA活性可延长血小板存活周期，因此PKA活性对于ITP这类血小板数量相关疾病的治疗有深远意义^[14]。

图7 敲除PKA基因后血小板的存活情况

注：图F表示对比野生小鼠，PKA敲除小鼠的血小板数量显著性下降；图H表示PKA敲除小鼠的血小板寿命明显缩短；+/+和PKA+/+指野生型小鼠，+/-指PKA杂合小鼠，-/-和PKA-/-指PKA基因敲除小鼠。

此外GPIba簇集能诱导肝脏血小板吞噬清除，而在GPIba诱导的血小板减少模型中，急性ITP模型上可以观察到血小板在脾脏及肝脏中快速破坏，体内血小板生成素（TPO）水平增高，但慢性模型中，TPO水平没有显著变化，并且GPIba自身抗体也不影响ITP患者体内TPO水平^[15]。

小结

1.抗GPIba抗体诱导的血小板凋亡，主要是通过激活Akt信号通路，该通路中PKA作为关键稳态调节因子，能决定血小板寿命和存活。

2.GPIba诱导的ITP模型中，急性模型上观察到TPO水平增高，而慢性中则没有显著改变。

机制4：骨髓微环境

周围的“小伙伴”如何影响血小板的存活？

北京大学、苏州大学的研究表明，ITP患者中骨髓转录因子HIF-1水平降低，HIF-1能够调控鼠骨髓细胞来源的巨核细胞的大小和数量，及其多倍体与CD41⁺细胞的比例^[16]。

香港大学的报告指出^[17]，5-HT（5-羟色胺）能够刺激人巨核细胞结构（CPU-MK）形成，促进巨核细胞增殖，降低巨核细胞凋亡并刺激Akt磷酸化。体外实验中还观察到5-HT能促进人骨髓巨核细胞血小板前体形成。

图8 5-HT刺激MK细胞增殖示意图

北京大学人民医院的研究表明，急速耐药的ITP患者中存在骨髓内皮前体细胞受损的情况，采用阿托伐他汀纠正骨髓内皮前体细胞数量和功能，能为此类病人提供新的治疗选择^[18]。

2019年美国血液学会年会（ASH）会议上Oliver Herd教授指出，ITP患者体内多能祖细胞和造血干细胞增加，促使长期造血干细胞定向分化、骨髓造血相关基质细胞扩增、平均血管面积增加，从而促进造血。

小结

骨髓中的HIF-1、5-HT和其他细胞如骨髓内皮前体细胞、造血干细胞等对血小板的生存有一定影响。

机制5：肠道微环境

这次“肠道菌群”可能要背锅！

近几年有学者发现肠道微环境异常与ITP具有疾病相关性。ITP患者的肠道菌群失调，与对照组相比，变形杆菌、拟杆菌比例增加，而厚壁菌的比例降低，此外厌氧菌、萨特菌、消化链球菌、肉毒杆菌等可作为ITP的潜在标志^[19]。

参考资料：
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本文首发：医学界血液频道

本文作者：林亦

责任编辑：Amelia

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