药融会|万新医药生物部首席专家方宏清：多肽生物合成
药融圈第149场专享会嘉宾：方宏清万新医药生物部首席专家
今天主题是多肽的生物合成，分3个部分介绍。
一、多肽的概念
二、多肽的制备方法。
三、实例介绍：N-乙酰化胸腺素β4的生物合成。
多肽是由氨基酸通过肽键连接形成的聚合物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等等。通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。也有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10~50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。蛋白质有时也被称为多肽。
多肽制备方法有三种：
1、发酵或酶法降解蛋白质；
2、化学合成方法；
3、生物合成（基因工程、重组技术）方法。
•1953，第一个化学合成多肽药物催产素，由9个氨基酸组成。
•1974，第一生物合成多肽药物胰岛素，由51个氨基酸残基组成。
•当氨基酸残基数较多（~30aa以上）时，基本采用生物合成方法。
•生物合成的优点是大规模生产时成本低、环境相对友好。缺点是难以实现非天然氨基酸掺入及其它修饰。
•生物合成蛋白质或多肽，多数采用哺乳动物细胞表达系统和微生物表达系统（大肠杆菌、酵母等）。哺乳动物细胞表达系统可以实现糖基化修饰等，单成本高；微生物表达系统产量高、成本低。
一、表达策略
分泌表达：将小肽分泌到细胞周质或培养基中以避免被细胞内蛋白酶降解。
融合表达或串联体表达：需要切割步骤释放单体肽。
二、切割与修饰
切割方法：包括化学切割、酶法切割和Intein介导的切割。
特殊修饰：与相关酶基因共表达。
分泌表达：
•可采用酵母表达系统、大肠杆菌表达系统等。
•与胞内表达相比，重组蛋白分泌到胞周质或胞外培养基显示出了许多优势
具体表现如下：
1）利用大肠杆菌系统，在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽，可将目的蛋白运送到周质空间。经信号肽酶将信号肽切除后，即可获得与天然蛋白一致的结构（不含N 端多余的甲硫氨酸）。
2）大肠杆菌的周质空间和胞外培养基中的蛋白酶活性要比胞质中低，多肽分泌到周质中能避免被胞内蛋白酶降解。
3）由于周质中杂蛋白较少，重组蛋白更容易纯化。
4）细胞周质提供的氧化环境有利于二硫键的正确形成。
大肠杆菌中分泌表达常用信号肽，信号肽名称，氨基酸残基序列*
利用大肠杆菌碱性磷酸酯酶的启动子和信号肽成功地将胸腺素α1分泌至培养基中，分泌表达量达到每升500毫克，经分离纯化，得到N端非乙酰化的重组胸腺素α1。
利用ompF 信号肽将人b-内啡肽分泌到培养基中。
α因子信号肽，酵母分泌表达GLP-1类似物。
分泌表达采用酵母的较多，大肠杆菌难度大。
大肠杆菌分泌表达做的好是国外一家公司，能达到10g/L左右。我在安徽大学任讲席教授期间，做过一段时间大肠杆菌分泌表达系统研究，表达抗体Fab片段，通过多种基因改造，包括大片段删除，表达水平在摇瓶中可以达到近100mg/L（分泌到培养基中）
融合表达：十个氨基酸组成的多肽，通常难以在胞内直接表达。常采用和其他多肽序列融合表达的方式。
融合载体的选择：分子量小、高表达、易切割
Trx或GST：可溶表达，Trx (12kDa)，GST(26kDa)
PurF：形成包涵体 ,适用于不含二硫键的多肽表达，常用羟胺切割 SUMO：可溶11kDa
Intein：可溶或包涵体。选择合适的融合载体后，就要考虑切割释放目的肽段问题了。
融合蛋白切割可分为三类：
1、化学切割
2、特异性酶切割
3、自我切割：FrpC 、 Sortase A 、Intein（内含肽）
常用化学切割方法：
溴化氢：切割Met-X之间的肽键，释放肽键C端的完整肽端；
羟胺：特异性切割Asn-Gly肽键；
稀酸：水解Asp-Pro肽键；
CDAP：则诱导X-Cys肽键的断裂。
缺点：有较多的副产物
化学切割的文献案例
将抗菌肽indolicidin的串联体与硫氧还蛋白融合表达，表达产物经溴化氢切割得到活性单体。
用羟胺切割抗菌肽halocidin融合蛋白，获得分子量约2kDa的十八肽。
用甲酸切割融合蛋白获得抗菌肽LL-37。
用CDAP切割获得PTH 1-34。
常用特异性切割蛋白酶
肠激酶：D-D-D-D-K-↓-X (X为除Pro以外的残基)
Factor Xa：I-E/D-G-R-↓-X (X为除Arg和Pro以外的残基)
Thrombin：L-V-P-R-↓-G-S，L-V-P-R-↓-G-F，M-Y-P-R-↓-G-N
TEV：E-X-X-Y-X-Q-↓-S
最佳切割序列为E-N-L-Y-F-Q-↓-S
Furin：R-X-K/R-R-↓-X
HRV 3C Protease：LeuGluValLeuPheGln ↓ GlyPro
天冬酰胺内肽酶：-Asn-↓-Gly-
SUMO蛋白酶：识别特定的结构域
识别SUMO的空间结构，不是一级序列，非常稳定，能耐受，2M尿素、0.1M、盐酸胍0.15M NaCl、0.3M咪唑、1%Triton X-100、20mM DTT或2-ME、20mM GSH
特异性蛋白酶切割的文献案例：
用肠激酶切割硫氧还蛋白融合蛋白获得由33个氨基酸残基组成的抗菌肽adenoregulin。
用肠激酶切割重组融合蛋白获得39个残基组成的GLP-1受体的长效激动剂exendin-4。
用凝血酶切割GST融合蛋白获得由牛乳铁蛋白衍生的25个氨基酸残基组成的抗菌肽LfcinB。
用泛素水解酶切割泛素融合蛋白，每升可以得到15mg抗菌肽。
用Furin蛋白酶切割抗菌肽串联体，每升获得了167mg的抗菌肽histonin。
用亮氨酸氨肽酶切割(HHL)40串联体，每升获得了6.2mg的抗高血压三肽HHL。
自我切割技术
FrpC (from Neisseria meningitidis ) 当加入钙离子后，FrpC能在Asp和Pro之间发生自我切割。体外切割反应十分迅速，6h后几乎100%切割。缺点是切割后，目的蛋白C端会产生多余氨基酸残基Asp。
Sortase A转肽酶(from Staphylococcus aureus)：将SrtAc的催化中心与其识别序列LPETG融合便形成了自我切割模型。当加入5mM Ca2+和5mM GGG后，识别序列LPETG的 Thr-Gly键发生切割。通常25℃反应4-6h可以完成切割反应产生目的蛋白。切割后目的蛋白N末端会留下多余的Gly残基。
Intein（Internal proteins）：内含肽，是一种蛋白剪接元件，它可以介导自身从蛋白前体中切除，同时将两侧蛋白-exteins (External proteins)进行相连，形成全长的外显肽。 它是一个翻译后自催化加工过程，它不需要酶或其他辅助因子的参与。Intein在空间上分为三个区域，即N端结构域，C端结构域和中间的归巢内切酶结构域（微型Intein中不存在）。N端和C端结构域形成Hint结构域，在该结构域催化下Intein介导蛋白发生剪接。
nteins的结构特征
(a) 经典Intein；(b) 微型Intein
Intein介导的蛋白质剪接是一个自催化加工过程。
前面提到的Intein都是来自一个前体蛋白，其自切割方式称为顺式剪接（cis-splicing）。此外，许多生物体中还存在反式剪接（trans-splicing）的Intein（也称为split intein），可以将两个不同基因编码的蛋白连接。
将Intein的N末端或者C末端氨基酸残基突变，可以阻断剪接过程，但不影响其C端或者端切割功能。这些Intein可以分为两类：一种为改变pH诱导发生C端切割的Intein，另一种是用巯基试剂诱导N端或者C端切割的Intein。
Intein的N端诱导切割：将Intein的C末端Asn残基突变为Ala可以阻断剪接和C端肽键断裂，但不阻断N-S/O酰基重排介导的N端肽键断裂。
将Intein的N末端Cys残基突变为Ala，将目的蛋白融合在Intein的C端则可以通过改变pH的方式来诱导自切割，避免使用巯基试剂诱导切割，会破坏一些富含二硫键的分子结构。
pH诱导型Intein最大的缺点是胞内表达过程中，融合蛋白自我切割去除亲和标签的现象比较严重，这就导致目的蛋白胞内损失严重，得率较低。巯基试剂诱导型Intein介导融合体内表达时体内自切割较少，因此通常目的蛋白得率较高。
蛋白质的翻译后修饰：
乙酰化
磷酸化
硫酸化
脂酰基化
糖基化
重组表达实现修饰方法：
拓展遗传密码：如，Tyr的硫酸化与细胞之间通讯、病毒入侵等有关。将TAG改造为编码sulfotyrosine 的密码子，可以在大肠杆菌内表达位点特异性硫酸化蛋白。
重组表达实现修饰方法：
拓展遗传密码：如，Tyr的硫酸化与细胞之间通讯、病毒入侵等有关。将TAG改造为编码sulfotyrosine 的密码子，可以在大肠杆菌内表达位点特异性硫酸化蛋白。
与酶基因共表达： 如，肉豆蔻酰转移酶、乙酰转移酶、蛋白激酶（磷酸化）、羟化酶、糖基转移酶
胸腺素β4是具有N端乙酰化修饰的43肽。一级结构和二级结构
临床应用
滴眼剂 ——正在进行中重度干眼症治疗的临床研究
注射剂 ——正在进行急性心肌脑损伤的临床研究
凝胶剂 ——正在进行治疗大疱性表皮松解症的临床研究
胸腺素β4生物合成策略思考：
目前在临床研究的样品是采用化学合成的。生物合成存在两个问题：N端乙酰化修饰、小分子肽表达困难。
如何实现N端乙酰化修饰呢？找到合适的酶。胸腺素β4在大肠杆菌中表达时是没有乙酰化修饰的， 因为没有对应的乙酰转移酶存在。所以第一步要找到该酶。
真核细胞中的乙酰转移酶底物虽广，但结构比较复杂，难以在大肠杆菌中表达。
古生菌在进化上介于细菌和真核生物之间，其乙酰转移酶结构简单，底物范围也较细菌的广。
我们在古生菌中找到一个合适乙酰转移酶。
古生菌——细菌与真核生物之间的桥梁。
首先在体外反应体系中进行酶的特异性筛选：古生菌的乙酰转移酶具有更广的底物，可以对胸腺素β4进行乙酰化修饰。
利用基因编辑方法构建可N-乙酰化修饰多肽大肠杆菌：
在找到所需要酶后，进行表达设计。表达策略上，将胸腺素β4置于融合蛋白的N末端， 下面就要选择合适切割方法了。根据结构特点，我们选择Intein进行融合表达。
重组人N-乙酰化胸腺素β4的表达及纯化
在大肠杆菌中实现了高表达，经过切割纯化获得目标多肽，质谱测定分子量与理论值一致，序列分析也证明确实是乙酰化的,这个多肽没有二硫键,二硫键的多肽通常采用酶切割技术,反相RP-HPLC Trypsin消化，捕获目的肽段，再串联质谱 ,可以采用疏水层析、离子交换、反相,串联质谱可以对肽段序列进行分析，确定乙酰化修饰位点 ,每升能获得200mg以上纯品 ,若采用高密度发酵，产量可进一步提高。