李乐园：读懂微生物王国的故事

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大家好，今天和大家分享一个技术方法，这个方法能够帮助我们去解读微生物王国正在发生的故事。

我叫李乐园，来自国家蛋白质科学中心·北京。很荣幸在热心肠研究院的肠道演讲，与大家初次相识。

本演讲的幻灯片 .pdf 版将在热心肠菌群微信群分享，感兴趣的读者请按以下方法申请入群：

重新认识细菌

我们初次认识一件事物，第一印象往往很重要，因为它潜移默化地影响着我们对这件事物的理解。

这可能是我们很多人刚刚接触微生物学时，在课堂上学到的细菌细胞的构造。我们了解到，一个细菌的细胞主要由染色体、细胞膜、细胞壁、细胞质、鞭毛等等部分构成。国内外的课程大概都是这样开始介绍的。

其实这些插图漏掉了微生物细胞中非常重要的一群主人公。被细胞质这个词一笔带过的部分，实际上比图上描绘的要复杂的多。

我们再来看下面这一张图。

这张图是不是和我们刚才看到的、我们曾经第一印象中的微生物不太一样呢？

图上蓝紫色的部分多了很多密密麻麻的小颗粒物，这些小颗粒所在的部分就是我们刚才所看到的曾经在课程中被画成匀浆的细胞质。

我们把这张图放大就会发现，这里面密密麻麻地布满了各种蛋白质。在一个细菌的细胞中，这些蛋白质大约占到细胞干重的50%左右，是细菌细胞中含量最大的生物大分子。

不仅含量高，这些蛋白质还非常的多样。在一个细菌中往往包含着上千种不同的蛋白质，它们的结构、功能极为精妙和复杂。

我们来看这样一张图。这个是细菌中由10余种不同蛋白质组成的鞭毛系统，是细菌的运动元件。这个鞭毛系统的结构它是一个什么样的作用呢？

我们来看这边这张图，它是一个直升机的旋翼的构造。我们来对比发现，它们的结构是不是有着非常有趣的相似性呢！

所以我们说，大自然是最好的工程师。

在一个细菌的细胞中有各种各样不同的蛋白质，像一个一个复杂精妙的机器一样，发挥着各种各样的作用。让这个细胞能够进行正常的功能运转，或者让这个细菌能够像宇宙飞船一样，在环境中进行穿梭。

洞悉微生物群落

我们还可以把一个微生物比作一个“工厂”，这些不同的蛋白质就好比工厂中组成复杂机器的一个一个的“零件”。每一个零件都有一个“图纸”，也就是我们细菌中的遗传物质。

细菌是非常聪明的，它不会同时表达所有的蛋白质。也就是说这个工厂它不会同时安装所有的零件，而是在需要的时候从这个“图纸集”中调取特定的“零件”来实现特定的功能。

比如说一个生产手套的工厂，在冬天的时候用一套零件组生产手套。在换季的时候，它又调取了另外一个零件组生产袜子。

其实在一个细菌中就发生着这样的事情。比如说这个研究，研究人员改变大肠杆菌培养基中的碳源，然后就会发现，大肠杆菌蛋白质表达是对应着相应的通路，有一个蛋白质表达的切换。

不仅特定代谢通路有蛋白质表达的差异，当我们去观察微生物的整个蛋白质组，我们会发现，当培养基成分有一个切换的时候，微生物的整个蛋白质组的不同功能蛋白的组成也发生着一个非常大比例的切换。

一个微生物群落是由许许多多不同的微生物物种组成的。不妨让我们一起来发挥一下想象力，把一个微生物群落想象成是由很多微生物“工厂”和微生物“飞船”组成的微生物王国。

如果我们去分析这些微生物的DNA图纸集，我们可以知道这个微生物王国有哪些成员，这些成员可能会发挥什么样的作用。

我们仍然需要更直接地去量化这些成员的实际功能，弄清这些成员安装了哪些蛋白质零件和机器，它们是如何应对环境变化作出响应的。

这是李乐园特聘研究员专为《肠·道》演讲绘制的插画

这个微生物王国与它坐落的外界环境，也就是人体的器官、组织和细胞，构成一个相互影响的生态系统。

我们可以想象一下，当一个微生物王国的运行状态是生态友好、可持续发展的，它将和周围的环境构成一个良好的共存关系；而当一个微生物王国它的状态不佳，一些工厂装错了蛋白质机器，向环境产生了有害物质，也导致生态环境的恶化，在人体中就可能对应一个疾病的状态。

分析这个王国在特定时刻表达的蛋白质，可以帮助我们更好地去认识健康和疾病状态下微生物的功能差异。

走进宏蛋白质组学

我们如何去量化一个微生物群落的蛋白质组成及其变化呢？

随着生命科学进入到后基因组、蛋白质组时代，技术之光使得分析复杂微生物群落的蛋白质组成成为可能。

我今天想与大家分享一个我经常用到的方法，这个方法叫做宏蛋白质组学。

宏蛋白质组学是一项采用高分辨率、高精度的质谱，去量化复杂微生物群落样本的蛋白质组成的方法。

宏蛋白质组学起源

宏蛋白质组学（metaproteomics）这个词，最早由卢森堡大学的Paul Wilmes教授等在2004年提出。当时的这项研究采用2D-PAGE、Q-ToF质谱和从头测序方法，从环境微生物群落样品中分析出了3个蛋白质胶点，也由此证实了从复杂样品中分析蛋白质的可行性。

在这篇文章中，首次对宏蛋白质组学进行了定义：宏蛋白质组学是大规模地分析特定时刻下，环境微生物群中所表达的所有蛋白质组成的技术。

此后在2009年，宏蛋白质组学的概念从环境样本延伸到了人体微生物群样本。Janet Jansson教授团队第一次采用液相色谱-串联质谱分析人类肠道微生物群，最多从单个样品中鉴定到了1300多个微生物蛋白质。

从那以后也逐渐形成了目前最常用的宏蛋白质组学流程。

宏蛋白质组学流程

我们将宿主或环境样品中的微生物细胞纯化出来，提取这些微生物中的蛋白质，采用蛋白酶进行特异性酶切。

酶切后的肽段通过质谱进行样本分析，我们将获得的一系列谱图，与微生物组蛋白质数据库、理论酶解获得的计算机谱图进行比对和匹配，从而获得蛋白质的鉴定和定量信息。

与单个物种蛋白质组学相比，宏蛋白质组学的分析流程更为复杂。这是由于我们用于分析整个微生物群落的宏蛋白质组学数据库非常的庞大，因而技术上具有更大的挑战性。

对于宏蛋白质组学的下游数据分析，也形成了比较系统性的分析流程。

我们拿到一个宏蛋白质组的数据库搜索结果，最常用的是蛋白质表达的丰度表格，这些蛋白质多数可以对应到不同级别的分类学信息。

采用蛋白质表达的丰度表格，我们还可以对不同实验分组之间的蛋白质表达进行差异蛋白质表达分析、样本的聚类分析，对感兴趣的蛋白质可以进行功能注释分析、代谢通路分析、网络分析等等。

目前，人类肠道宏蛋白质组的分析深度不断提高。

近期分析深度较深的研究工作，已经可以从单个肠道样本中分析到大约7万个独特微生物肽段，对应3万个蛋白质小组。

我们有理由相信，在短时间内技术的进步，能够使宏蛋白质组分析取得更多突破性的进展。

宏蛋白质组学应用

有了宏蛋白质组学这个方法，能够帮助我们做些什么事情呢？

目前宏蛋白质组学已经被较为广泛地应用于人类、动物、环境、健康各个领域。其中在人类健康的研究中，目前有大约90%的宏蛋白质组学技术研究和应用的文章关注于肠道。

肠道微生物群的宏蛋白质组对环境的变化是非常敏感的。我们在体外培养肠道微生物群发现，每当改变一个培养基中的成分，宏蛋白质组都会有非常大的响应。

借助这种性质，我们就可以去优化肠道微生物群的体外培养基，让这个微生物群在体外也维持和体内相似的功能表达，并且在外界条件刺激下产生相似的功能响应。

采用这个体外培养出来的微生物王国，结合宏蛋白质组分析，我们形成了一项叫做RapidAIM的高通量药物功能响应分析流程，可以个体化地去分析药物和其他外源物质对肠道微生物群所表达的功能的影响。

例如，我们可以去观察感兴趣的特定通路上，酶的丰度对单个环境因子的响应。

我们的肠道微生物群，常被科学家们比作一个热带雨林。我们采用生态学的方法去研究一个热带雨林，同样的，我们是不是也可以考虑用生态学的方法去研究肠道的微生态系统呢？

宏蛋白质组学将为微生态系统的研究提供非常有帮助的数据。

面向微生物生态系统研究的应用，宏蛋白质组学的技术手段可以帮助我们进行时间和空间尺度上的功能分析，从功能的角度去解析不同微生物之间的相互作用，进行跨界的宏蛋白质组学分析，作为生态系统模拟的有用数据等等。

借助这些多样的方法和角度，来深入地解读微生物组这个生态系统发生的故事，是我们课题组感兴趣和今后要努力的研究方向。

最后，尽管宏蛋白质组学这项技术的应用也呈现日益上升的趋势，我们在应用这项技术的时候，也需要了解到目前技术的一些局限性，去合理地进行应用。

目前，常规的宏蛋白质组学分析流程还不能覆盖大部分低丰度的蛋白质。根据文献估计，目前比较好的分析方法能够分析到肠道中所表达的微生物蛋白质种类的10%~20%。

因此，后续的技术发展还有着非常大的空间和挑战。我们在提高分析深度、质谱分析新技术、优化搜库算法、宏翻译后修饰组、蛋白质跨界互作等等方面都将会有更大的发展前景。

相信未来的技术之光能够帮助我们，越来越清晰地去读懂微生物王国正在发生的故事。

谢谢大家！

本次演讲由SEIMEI森美品牌赞助，于2022年12月26日录制于北京。