lncRNA的鉴定专题-主流的鉴定软件

lncRNA鉴定的思路

lnc鉴定的思路是：先构建转录本并进行组装，然后将组装的转录本去除已知编码基因，最后使用编码评估软件进一步去除编码基因，得到非编码基因候选集，再使用“长度>200”和“外显子数>1”对非编码基因候选集进行过滤即可。

lncRNA鉴定的实现

1. 构建并组装转录本

   转录本构建

   可以使用Cufflinks或Scripture，其区别是：

   Cufflinks（推荐）：报出最少的可变剪切组合，力求转录本更长。

   Scripture：报出最全的可变剪切组合，力求转录本更全。

   Cufflinks使用方法

   Cufflinks程序主要根据Tophat的比对结果，依托或不依托于参考基因组的GTF注释文件，计算出(各个gene的)isoform的FPKM值，并给出trascripts.gtf注释结果(组装出转录组)。

   $ cufflinks [options]* <aligned_reads.(sam/bam)>   
   两个常用的例子：   
   $ cufflinks -o cufflinks_output tophat_out/accepted_hits.bam  # 构建转录本
   $ cufflinks -p 8 -G transcript.gtf –library-type fr-unstranded -o cufflinks_output tophat_out/accepted_hits.bam # 定量转录本
   

   普通参数

   -h | –help   
   -o | –output-dir <sting>  default: ./   
      设置输出的文件夹名称   
   
   -p | –num-threads  default: 1   
      用于比对reads的CPU线程数   
   
   -G | –GTF <reference_annotation.(gtf/gff)>   
      提供一个GFF文件，以此来计算isoform的表达。此时，将不会组装新的transcripts，   
   程序会忽略和reference transcript不兼容的比对结果   
   
   -g | –GTF-guide <reference_annotation.(gtf/gff)>   
      提供GFF文件，以此来指导转录子组装(RABT assembly)。此时，输出结果会包含ref  
   erence transcripts和novel genes and isforms。   
   
   -M | –mask-file <mask.(gtf/gff)>   
      提供GFF文件。Cufflinks将忽略比对到该GTF文件的transcripts中的reads。该   
   文件中常常是rRNA的注释，也可以包含线立体和其它希望忽略的transcripts的注释。将这   
   些不需要的RNA去除后，对计算mRNA的表达量是有利的。   
   
   -b | –frag-bias-correct <genome.fa>   
      提供一个fasta文件来指导Cufflinks运行新的bias detection and correct   
   ion algorithm。这样能明显提高转录子丰度计算的精确性。   
   
   -u | –multi-read-correct   
      让Cufflinks来做initial estimation步骤，从而更精确衡量比对到genome多个   
   位点的reads。   
   
   –library-type  default:fr-unstranded   
      处理的reads具有链特异性。比对结果中将会有个XS标签。一般Illumina数据的lib   
   rary-type为 fr-unstranded。  
   

   丰度评估参数

   -m | –frag-len-mean default: 200   
   插入片段的平均长度。不过现在Cufflinks能learns插入片段的平均长度，因此不推荐自主   
   设置此值。   
   
   -s | –frag-len-std-dev default: 80   
   插入片段长度的标准差。不过现在Cufflinks能learns插入片段的平均长度，因此不推荐自   
   主设置此值。   
   
   -N | –upper-quartile-form   
   使用75%分为数的值来代替总的值(比对到单一位点的fragments的数值)，作normal   
   ize。这样有利于在低丰度基因和转录子中寻找差异基因。   
   
   –total-hits-norm default: TRUE   
   Cufflinks在计算FPKM时,算入所有的fragments和比对上的reads。和下一个参数   
   对立。默认激活该参数。   
   
   –compatible-hits-norm    
   Cufflinks在计算FPKM时，只针对和reference transcripts兼容的fragmen   
   ts以及比对上的reads。该参数默认不激活，只能在有 –GTF 参数下有效，并且作 RABT   
   或 ab initio 的时候无效。  
   

   组装常用参数

   -L | –label  default: CUFF   
      Cufflink以GTF格式来报告转录子片段(transfrags),该参数是GTF文件的前缀   
   
   –min-frags-per-transfrag <int>  default: 10   
      组装出的transfrags被支持的RNA-seq的fragments数少于该值则不被报道。   
   
   –min-intron-length <int>  default: 50   
      最小的intron大小。   
   
   –overlap-radius <int>  default: 50   
      Transfrags之间的距离少于该值，则将其连到一起。  
   

   转录本组装

   使用Cuffmerge将构建的多个转录本进行组装：

   Cuffmerge将各个Cufflinks生成的transcripts.gtf文件融合称为一个更加全面的transcripts注释结果文件merged.gtf，Cuffmerge不是简单的去重求并集，得到的转录本会更加精准。

   Cuffmerge使用方法

   $ cuffmerge [options]* <assembly_GTF_list.txt>   
   输入文件为一个文本文件，是包含着GTF文件路径的list。常用例子：   
   $ cuffmerge -o ./merged_asm -p 8 assembly_list.txt  
   

   使用参数

   -h | –help   
   -o <output_dir> default: ./merged_asm   
   将结果输出至该文件夹。   
    -g | –ref-gtf   
   将该reference GTF一起融合到最终结果中。   
    -p | –num-threads <int> defautl: 1   
   使用的CPU线程数   
    -s | –ref-sequence <seq_dir>/<seq_fastq>   
   该参数指向基因组DNA序列。如果是一个文件夹，则每个contig则是一个fasta文件；如果是   
   一个fasta文件，则所有的contigs都需要在里面。Cuffmerge将使用该ref-sequence来   
   帮助对transfrags分类，并排除repeats。比如transcripts包含一些小写碱基的将归类   
   到repeats.  
   

Cuffmerge与Cuffcompare都可以合并转录本，两者的异同为：

相同点：都是合并转录本的工具

• 输入：若干gtf文件

• 输出：合并的gtf文件

不同点：

Cuffcompare：得到一个转录本的并集，不丢弃转录本

Cuffmerge：按基因位置深度重新构建转录本，深度优化转录本结构

1. 去除编码基因

   使用Cuffcompare将构建组装得到的merge.gtf和reference gtf进行比较，只选择class code为I、U与X。

   i: A transfrag falling entirely within a reference intron
   u: Unknown, intergenic transcript
   x: Exonic overlap with reference on the opposite strand
   

   Cuffcompare使用方法

   $ cuffcompare [options]* <cuff1.gtf> [cuff2.gtf] … [cuffN.gtf]   
   
   使用例子：   
   $ cuffcompare -o cuffcmp cuff1.gtf cuff2.gtf  
   

   使用参数

   -h   
   -V   
   -o <outprefix> default: cuffcmp   
   输出文件的前缀   
   
   -r <reference_mrna.gtf>   
   参考的GFF文件。用来评估输入的gtf文件中gene models的精确性。每一个输入的gtf的is   
   oforms将和该参考文件进行比较，并被标注为 overlapping, matching 或 novel。   
   -R   
   当有了 -r 参数时，指定该参数时，将忽略参考GFF文件中的一些transcripts。这些tran   
   scripts不和任何输入的GTF文件overlapped。   
   -s <seq_dir>/<seq_fastq>   
   该参数指向基因组DNA序列。如果是一个文件夹，则每个contig则是一个fasta文件；如果是   
   一个fasta文件，则所有的contigs都需要在里面。小写字母的碱基用来将相应的transcri   
   pts作为repeats处理。  
   

2. 预测编码与非编码RNA

   预测编码与非编码RNA是鉴定lncRNA的关键，CPC、phyloCAF及CNCI可以完成预测，他们的区别如下：

   CPC ：算法基于预测基因的开放阅读框

   特点：模型不能跨物种，不适用高通量测序得到的RNA

   PhyloCSF：算法基于物种间的保守性

   特点：依赖于基因组，计算耗时

   CNCI：算法基于二联密码子频率

   特点：可以扩物种预测，人的模型能用其它各种动物上

   有关于这三个软件的用法，见本周主题的后续文章，敬请期待。

参考资料：

1. 第四讲：转录本构建和lncRNA鉴定。测序中国。

2. Cuflinks的使用方法。生物日至|鸣一道。

3. Cuffmerge Cuffcompare Cuffdiff 的使用方法。生物日至|鸣一道。

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