StatQuest生物统计学专题 - RPKM,FPKM,TPM
其实RPKM,FPKM,TPM的概念和应用，大家或多或少的都知道。生信菜鸟团以前的专题也已经讲过这几个概念：浅谈RPKM,FPKM,RPM,TPM的区别。在本专题里面重提这个话题，是基于这样一个考虑：RPKM,FPKM,TPM的生物学意义其实很简单，计算时的逻辑其实也很清楚，但是偏偏它的数学形式很复杂，全名也很绕。
以RPKM为例：
全名为：
Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads.
计算方式为：
RPKM= total exon reads/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))；
其中，
total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；
mapped reads (Millions) :某个样本的所有reads总和；
exon length(KB)：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以KB为单位）.
希望你第一次见到这些的时候不是晕的，而本专题重新提到他们，是因为他们其实很简单。
RPKM,FPKM,TPM是为了消除基因长度和测序深度的影响
在RNA-Seq的分析中，为了获得差异表达基因，只需要对不同基因的测序Read数进行比较即可。然而比对到不同基因上的Read数目并不能直接用于比较这两个基因的表达量差异，因为在RNA-seq中有一个很浅显的道理，基因越长，比对到此基因上的Read就会越多；测序深度越大，那么本次RNA-seq的所有Read数都会增加。也就是说Read数除了和基因表达量相关外，也和基因的长度、测序深度有关，因此为了比较多个RNA-seq重复（测序深度有一定差异）的不同基因（基因长度有一定差异）之间的表达量差异，那么就不能使用Read数直接进行比较，而是需要对Read数进行标准化。
计算RPKM,FPKM,TPM的一个例子
RPKM的计算逻辑
RPKM的计算逻辑其实很简单，我们刚才已经说过，测序Read数是会受到基因长度和测序深度影响的，所以RPKM就是为了消除这两项偏差，那么如何消除呢？
既然受到基因长度影响，那么将测序Read数除以基因长度就OK了，而受到测序深度影响，那么再将Read数除以总Read数进行标准化也就消除了测序深度的影响。
只不过这里基因长度是用kb表示的，所以RPKM中是K，Kilobase。而总Read数太大了，直接除以这个数字就会使得标准化出来的Read数出现太多的小数，所以为了美观，一般都是除以以百万为单位的总Read数，举例来说，假定一次RNA-seq的总Read数为2*10^7，那么在进行Read标准化的时候，并不是直接除以这个数值，而是除以20，因为2*10^7 = 20*10^6 = 20M，所以RPKM中才是M，Million。
总结一下，RPKM的计算方法：
计算总Read数：计算每一个RNA-seq样本的总Read数，然后将其换算为以百万位单位（M）；
标准化总Read数：将所有基因的Read数除以总Read数；
标准化基因长度：再将所有基因的Read数除以基因长度（基因长度单位为kb）；
计算RPKM的的一个例子
举例来说，假定有以下RNA-seq数据，测定了A、B、C、D四个基因，长度分别是2、4、1、10kb，共测定了3个生物重复：Rep1、Rep2、Rep3。
第一步，计算总Read数
由于只有4个基因，所以总Read数并没有太大，因此使用10模拟百万进行总read换算。
第二步：标准化总Read数
将Rep1、Rep2、Rep3除以各自换算后的总Read数（也就是3.5，4.5，10.6），得到RPM，见下图：
第三步：标准化基因长度
再将基因A、B、C、D的RPM值除以各自的基因长度，得到RPKM，见下图：
如此一个RPKM标准化就完成了。
FPKM与RPKM
其实FPKM同RPKM是一样的，只是RPKM用于单末端测序，而FPKM用于双末端测序。
二代测序时，会将所有的DNA打成片段（fragment），然后再去测序。单末端测序时，一个片段对应一个Read，但是双末端测序时，一个片段会从两端分别测定一次，因此这两个配对Read对应的是同一片段（偶尔也会有一个片段只对应一个Read的情况，另一个Read因为某些原因被剔除或丢失了）。
区别也就在这里，对于FPKM来说，配对到同一片段上的两个Read只会算作一个Read，也就是说FPKM是以Fragment为准，不以Read数为准，其他计算方式是完全一样的。
TPM的计算逻辑及例子
TPM的计算方法其实同RPKM很类似，同样的对基因长度和测序深度进行标准化，只不过RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化；而TPM是先进行基因长度标准化，后进行测序深度标准化。事实证明，TPM的标准化方法更有优势，为何会这样，见后述。这里先看看TPM的计算。
仍以图一的数据为例：
第一步：进行基因长度标准化
先将基因A、B、C、D的Read数除以各自的基因长度（基因长度单位kb），得到RPK。
第二歩：计算总Read数（RPK）
计算总Read数，并将其进行百万转换。由于基因数太少，这里是使用10模拟百万转换。
由于TPM先进行基因长度标准化，所以这里的总Read数计算已经变为基因长度标准化后的Read数，也就是RPK数。
第三步：进行总Read数标准化
将Rep1、Rep2、Rep3的RPK除以各自的转换后的总Read数，得到TPM值。
总结一下，TPM的计算方法：
标准化基因长度：将所有基因的Read数除以基因长度（基因长度单位为kb）；
计算总Read数：计算每一个样本的总Read数，然后将其换算为以百万位单位（M）；
标准化总Read数：将所有基因的Read数除以总Read数；
TPM相比较RPKM,FPKM的优势
目前都已经推荐进行TPM标准化，不再使用了RPKM、FPKM了，为何会这样？
先看看刚才的RPKM和TPM数据：
将每个转录本的相应RPKM和TPM值进行加总后，可以发现不同转录本的总RPKM并不相同，而进行TPM变换后的加总TPM值是相同的。事实上所有进行TPM变换后的转录本的加总TPM值都是相同的（正常情况下，是百万）。
这个差异会造成什么样的影响呢？
由于RNA-seq就是为了通过比较不同样本间的标准化后的Read数差异来得出基因表达量差异的结果的，那么不同样本的加总RPKM不同，就会导致无法通过直接比较RPKM值确定两者的差异。
举例来说，在不考虑统计差异的情况下，以基因A为例，Rep1的RPKM值为1.43，Rep3的RPKM值是1.42，那么能说基因A在Rep1中的表达量大于Rep3中的表达量吗？
答案是不能，因为Rep1的总RPKM值是4.29，而Rep3的总RPKM值是4.25，虽然Rep1中基因A的RPKM大，但是Rep1的总RPKM值也是较大的（说白了，RPKM的测序深度标准化并不完善）。
而对于TPM数据就不同了，由于总TPM都是相同的，Rep1中基因A的TPM值3.33大于Rep3中基因A的TPM值3.326，所以在不考虑统计学差异的情况下，可以直接得出Rep1中基因A的表达量是要大于Rep3的。
参考资料
StatQuest课程：https://statquest.org/video-index/
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