肿瘤外显子数据处理系列教程（八）不同注释软件的比较（上）：安装及使用

大家好，上一节我们将ANNOVAR的注释后的maf文件进行了可视化，这一节我们将比较不同注释软件(vep,annovar,gatk,snpeff) 的安装及使用。

首先按照我的代码习惯，都需要一个config文件来完成批量处理：

$ cat config
case1_biorep_A_techrep
case2_biorep_A
case3_biorep_A
case4_biorep_A
case5_biorep_A
......

ANNOVAR

安装

直接到官网：http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/，注册需要教育邮箱，获取到安装包后，解压便可使用，当然还需要下载数据库数据：

nohup ./annotate_variation.pl -downdb -webfrom annovar gnomad_genome --buildver hg38 humandb/ >down.log 2>&1 &

这里我只下载了人类hg38参考基因组的数据，就非常大了：

41G    humandb/

注释

根据ANNOVAR官网的说明，2019年10月24日已经更新了版本，本教程使用的ANNOVAR版本还是旧版了，旧版的ANNOVAR的注释比较复杂，在曾老师的博客中有多篇博文介绍它的用法，但主要看：ANNOVAR软件用法还可以更复杂：http://www.bio-info-trainee.com/4007.html，主要有3种类型的注释：

• 基于基因的注释， exonic,splicing,ncRNA,UTR5,UTR3,intronic,upstream,downstream,intergenic，使用 geneanno 子命令。

• 基于区域的注释， cytoBand,TFBS,SV,bed,GWAS,ENCODE,enhancers,repressors,promoters ，使用regionanno 子命令。只考虑位点坐标

• 基于数据库的过滤， dbSNP,ExAC,ESP6500,cosmic,gnomad,1000genomes,clinvar 使用 filter 子命令。考虑位点坐标同时关心突变碱基情况。

而我在这个系列教程中，用ANNOVAR对vcf文件所做的是基于基因的注释，注释脚本annovar.sh如下：

cat config | while  read id
do
echo "start ANNOVAR for ${id} " `date`
~/biosoft/ANNOVAR/annovar/table_annovar.pl ${id}_filter.vcf ~/biosoft/ANNOVAR/annovar/humandb/ \
-buildver hg38 \
-out annovar/${id} \
-remove \
-protocol refGene,knownGene,clinvar_20170905 \
-operation g,g,f \
-nastring . \
-vcfinput
echo "end ANNOVAR for ${id} " `date`
done 

注释的速度非常快，一个样本大概就是6~7秒就可以注释完，每个样本输出3个文件：

case1_biorep_A_techrep.avinput
case1_biorep_A_techrep.hg38_multianno.txt
case1_biorep_A_techrep.hg38_multianno.vcf

在文件case1_biorep_A_techrep.hg38_multianno.txt中的一个突变记录位点注释上的信息如下：

chr1    6146376 6146376 G       T       exonic  CHD5    .       nonsynonymous SNV       CHD5:NM_015557:exon11:c.C1638A:p.N546K  exonic  CHD5    .       nonsynonymous SNV       CHD5:uc001amb.3:exon11:c.C1638A:p.N546K,CHD5:uc057btb.1:exon11:c.C1638A:p.N546K .       .       .       .       .       0.25    .       75      chr1    6146376 .       G       T       .       PASS    DP=184;ECNT=1;NLOD=22.56;N_ART_LOD=-1.888e+00;POP_AF=1.000e-05;P_CONTAM=0.00;P_GERMLINE=-4.514e+01;TLOD=5.41    GT:AD:AF:F1R2:F2R1:MBQ:MFRL:MMQ:MPOS:SA_MAP_AF:SA_POST_PROB     0/1:97,3:0.058:48,1:49,2:37,38:154,210:60:20:0.020,0.030,0.030:0.018,3.223e-03,0.979    0/0:75,0:0.020:45,0:30,0:36,0:154,0:0:0

GATK注释

GATK的注释方法在我们系列教程的第五篇：GATK的最佳实践已经有提到，不过那个时候我们还没讲如何注释：

安装

注释只用到一个工具：Funcotator，帮助文档在：https://software.broadinstitute.org/gatk/documentation/tooldocs/4.0.6.0/org_broadinstitute_hellbender_tools_funcotator_Funcotator.php，但是，gatk-4.0.6.0版本的Funcotator工具是BETA版，还不是很稳定，我测试过了之后发现其注释结果与ANNOVAR或者VEP注释的结果相差较大，所以这里我们使用最新版本的gatk-4.1.4.0的Funcotator工具来做注释，方法比较简单，首先需要下载gatk-4.1.4.0.zip安装包，解压出来即可使用

wget -c https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.1.4.0/gatk-4.1.4.0.zip
tar -zxvf gatk-4.1.4.0.zip

然后需要下载数据库文件，是一个打包好的压缩文件，大小为237M，解压出来是3.4G：

nohup wget -c ftp://[e-mail]/bundle/funcotator/funcotator_dataSources.v1.6.20190124g.tar.gz &
tar -zxvf funcotator_dataSources.v1.6.20190124g.tar.gz 
## 237M    funcotator_dataSources.v1.6.20190124g.tar.gz
## 3.4G    funcotator_dataSources.v1.6.20190124g/

注释

然后使用GATK的Funcotator工具进行在线注释。用到的脚本Funcotator.sh如下：

GATK=/home/hcguo/biosoft/gatk/gatk-4.1.4.0/gatk
ref=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fasta
bed=/home/llwu/reference/index/human/CCDS/GRCh38.bed
source=/home/hcguo/database/gatk_funcotator/funcotator_dataSources.v1.6.20190124g
cat config | while read id
do
sample=$id
echo "start Funcotator for ${id} " `date`
$GATK  Funcotator -R $ref \
-V ${sample}_filter.vcf \
-O gatk/${sample}_funcotator.tmp.maf \
--data-sources-path ${source} \
--output-file-format MAF \
--ref-version hg38 
echo "end Funcotator for ${id} " `date`
done

注释的速度也相当快，一个样本10秒左右就注释好了，同样我们以case1_biorep_A_techrep这个样本为例，打开查看一下结果，这里跳过了头文件：

$ less case1_biorep_A_techrep_funcotator.maf|grep -v '^#'|head -2
Hugo_Symbol    Entrez_Gene_Id  Center  NCBI_Build  Chromosome  Start_Position  End_Position    Strand  Variant_Classification  Variant_Type    Reference_Allele   Tumor_Seq_Allele1    Tumor_Seq_Allele2   dbSNP_RS    dbSNP_Val_Status    Tumor_Sample_Barcode    Matched_Norm_Sample_Barcode Match_Norm_Seq_Allele1  Match_Norm_Seq_Allele2  Tumor_Validation_Allele1    Tumor_Validation_Allele2    Match_Norm_Validation_Allele1   Match_Norm_Validation_Allele2   Verification_StatusValidation_Status    Mutation_Status Sequencing_Phase    Sequence_Source Validation_Method   Score   BAM_File    Sequencer   Tumor_Sample_UUID   Matched_Norm_Sample_UUID    Genome_Change   Annotation_Transcript   Transcript_Strand   Transcript_Exon Transcript_Position cDNA_Change Codon_Change    Protein_Change  Other_Transcripts   Refseq_mRNA_Id  Refseq_prot_Id  SwissProt_acc_Id    SwissProt_entry_Id  Description UniProt_AApos   UniProt_Region  UniProt_SitUniProt_Natural_Variations   UniProt_Experimental_Info   GO_Biological_Process   GO_Cellular_Component   GO_Molecular_Function   COSMIC_overlapping_mutations    COSMIC_fusion_genes COSMIC_tissue_types_affected    COSMIC_total_alterations_in_gene    Tumorscape_Amplification_Peaks  Tumorscape_Deletion_Peaks   TCGAscape_Amplification_Peaks   TCGAscape_Deletion_Peaks    DrugBank    ref_context gc_content  CCLE_ONCOMAP_overlapping_mutations  CCLE_ONCOMAP_total_mutations_in_genCGC_Mutation_Type    CGC_Translocation_Partner   CGC_Tumor_Types_Somatic CGC_Tumor_Types_Germline    CGC_Other_Diseases  DNARepairGenes_Activity_linked_to_OMIM  FamilialCancerDatabase_Syndromes    MUTSIG_Published_Results    OREGANNO_ID OREGANNO_Values tumor_f t_alt_count t_ref_count n_alt_count n_ref_count Gencode_27_secondaryVariantClassification   ACMGLMMLof_LOF_Mechanism    ACMGLMMLof_Mode_of_Inheritance  ACMGLMMLof_Notes    ACMG_recommendation_Disease_Name    ClinVar_VCF_AF_ESP  ClinVar_VCF_AF_EXAC ClinVar_VCF_AF_TGP  ClinVar_VCF_ALLELEID    ClinVar_VCF_CLNDISDB    ClinVar_VCF_CLNDISDBINCL    ClinVar_VCF_CLNDN   ClinVar_VCF_CLNDNINCL   ClinVar_VCF_CLNHGVS ClinVar_VCF_CLNREVSTAT  ClinVar_VCF_CLNSIG  ClinVar_VCF_CLNSIGCONF  ClinVar_VCF_CLNSIGINCL  ClinVar_VCF_CLNVC  ClinVar_VCF_CLNVCSO  ClinVar_VCF_CLNVI   ClinVar_VCF_DBVARID ClinVar_VCF_GENEINFO    ClinVar_VCF_MC  ClinVar_VCF_ORIGIN  ClinVar_VCF_RS  ClinVar_VCF_SSR LMMKnown_LMM_FLAGGED    DP  ECNT    IN_PON  NLOD    N_ART_LOD   POP_AF  P_CONTAM    P_GERMLINE  RPA RU  STR TLOD    
CHD5    __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ hg38    1   6146376 6146376 +   Nonsense_Mutation   SNP G   G   T   __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ NA  NA  __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ g.chr1:6146376G>T   ENST00000262450.7   -   11  173c.1638C>A    c.(1636-1638)tgC>tgA    p.C546*     __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ CATCCATGTCGTTCTTTCTTT   0.5860349127182045  __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ __UNKNOWN__ 0.058   3   97  0   75         false    184 1       22.56   -1.888e+00  1.000e-05   0.00    -4.514e+01              5.41    

可以看到这个工具一下子注释了几十个数据库，有一百多列的信息，当然很多注释结果是__UNKNOWN__。

vep注释

在以前如要要用vep的话，安装比较麻烦，甚至需要管理员权限：http://www.bio-info-trainee.com/1600.html

也可以参考ensemble数据库对应的安装教程：http://asia.ensembl.org/info/docs/tools/vep/script/vep_download.html

里面介绍了多种方法，最后一种是用docker装vep，比较麻烦一点，但是也不难，需要学习一下docker，也是需要管理员权限，这个方法的好处在于，docker的vep镜像中已经把各种模块配置好了，启动镜像就可以用vep注释，不需要下载，如果你有管理员权限，可以尝试这种方法。如果没有管理员权限，也可以像我一样自己申请一台阿里云服务器，最低配置就好，对于这台服务器，你就有管理员权限啦，安装方法见上面的链接，这里就不再演示了（其实我也有试了其他几种方法的，但是最后都因为perl安装依赖模块缺失而放弃）

安装docker

sudo apt install docker-ce
docker --version
sudo add-apt-repository "deb [arch=amd64] https://download.docker.com/linux/ubuntu artful stable"
sudo docker run hello-world

用docker安装vep镜像

docker pull ensemblorg/ensembl-vep
docker run -t -i ensemblorg/ensembl-vep ./vep
# Create a directory on your machine:
mkdir $HOME/vep_data

# Make sure that the created directory on your machine has read and write access granted
# so the docker container can write in the directory (VEP output):
chmod a+rwx $HOME/vep_data    

docker run -t -i -v $HOME/vep_data:/opt/vep/.vep ensemblorg/ensembl-vep
docker run -t -i -v $HOME/vep_data:/opt/vep/.vep ensemblorg/ensembl-vep perl INSTALL.pl -a cfp -s homo_sapiens -y GRCh38 -g all

启动镜像

根据上面的教程，我们在家目录中新建了一个vep_data的文件夹，然后把我们需要注释的vcf文件拷贝到vep_data目录下，然后启动vep镜像：

sudo docker run -t -i -v $HOME/vep_data:/opt/vep/.vep ensemblorg/ensembl-vep

注释

用vep注释的脚本vep.sh如下：

cat /opt/vep/.vep/SRP070662_filter_vcf/config | while read id
do
echo "start vep_annotation for ${id} " `date`
./vep --cache --offline --format vcf --vcf --force_overwrite \
--dir_cache /opt/vep/.vep/ \
--dir_plugins /opt/vep/.vep/Plugins/ \
--input_file /opt/vep/.vep/SRP070662_filter_vcf/${id}_filter.vcf \
--output_file /opt/vep/.vep/VEP_annotation/${id}_vep.vcf 
echo "end vep_annotation for ${id} " `date`
done

注释后结果，每个样本会输出两个文件，一个是vcf文件，一个是html文件，如：

case1_biorep_A_techrep_vep.vcf
case1_biorep_A_techrep_vep.vcf_summary.html

同样的，我们查看一下样本case1_biorep_A_techrep_vep.vcf注释的结果，可以发现，vep的注释结果就是在原先的vcf文件的INFO列后面注释上了很多的信息，这些信息以|符号作为分隔

#CHROM    POS ID  REF ALT QUAL    FILTER  INFO    FORMAT  case1_biorep_A_techrep  case1_germline
chr1    6146376 .       G       T       .       PASS    DP=184;ECNT=1;NLOD=22.56;N_ART_LOD=-1.888e+00;POP_AF=1.000e-05;P_CONTAM=0.00;P_GERMLINE=-4.514e+01;TLOD=5.41;CSQ=T|missense_variant|MODERATE|CHD5|ENSG00000116254|Transcript|ENST00000262450|protein_coding|11/42||||1936|1638|546|N/K|aaC/aaA|||-1||HGNC|HGNC:16816,T|upstream_gene_variant|MODIFIER|CHD5|ENSG00000116254|Transcript|ENST00000462991|nonsense_mediated_decay|||||||||||2272|-1|cds_start_NF|HGNC|HGNC:16816,T|missense_variant&NMD_transcript_variant|MODERATE|CHD5|ENSG00000116254|Transcript|ENST00000496404|nonsense_mediated_decay|11/34||||1638|1638|546|N/K|aaC/aaA|||-1||HGNC|HGNC:16816        GT:AD:AF:F1R2:F2R1:MBQ:MFRL:MMQ:MPOS:SA_MAP_AF:SA_POST_PROB     0/1:97,3:0.058:48,1:49,2:37,38:154,210:60:20:0.020,0.030,0.030:0.018,3.223e-03,0.979    0/0:75,0:0.020:45,0:30,0:36,0:154,0:0:0

SNPEFF注释

安装

snpeff的安装方法也比较简单，参考：

http://snpeff.sourceforge.net/download.html#source

# Download latest version
wget http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/snpEff_latest_core.zip

# Unzip file
unzip snpEff_latest_core.zip

数据库文件，我们需要下载人类参考基因组hg38版本的注释文件Homo_sapiens，但是：By default SnpEff automatically downloads and installs the database for you, so you don't need to do it manually.软件默认下载了GRCh38.86，所以我们不需要自己下载，如果需要其他数据库，可以通过下面命令查询和获取下载的链接，有20000多个database，足够了，不过需要注意一下版本的问题：

java -jar snpEff.jar databases | less -S

注释

对于癌症样本，有其特定的注释方法：

http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff_manual.version_4_0.html#cancer

需要一个samples_cancer.txt文件，内容如下：

$ cat snpeff/samples_cancer.txt
case1_germline  case1_biorep_A_techrep
case2_germline  case2_biorep_A
case3_germline  case3_biorep_A
case4_germline  case4_biorep_A
case5_germline  case5_biorep_A
......

注释的脚本snpeff.sh如下

dir=~/SRP070662/8.mutect2/SRP070662_filter_vcf
config=~/SRP070662/8.mutect2/SRP070662_filter_vcf/snpeff/config
cat ${config} | while read id
do
echo "start snpeff_annotation for ${id} " `date`
java -Xmx4g -jar snpEff.jar -v \
-cancer -cancerSamples ${dir}/snpeff/samples_cancer.txt \
GRCh38.86 \
${dir}/${id}_filter.vcf > ${dir}/snpeff/${id}_eff.vcf 
echo "end snpeff_annotation for ${id} " `date`
done

这个运行速度比较慢一些，一个样本大概需要一分钟的时间，我们还是来看一下注释的结果，同样以这个样本case1_biorep_A_techrep为例：

$ head -1 case1_biorep_A_techrep_eff.vcf
chr1    6461445 .   G   T   .   PASS    DP=21;ECNT=1;NLOD=2.70;N_ART_LOD=-1.049e+00;POP_AF=1.000e-05;P_CONTAM=0.00;P_GERMLINE=-1.853e+00;TLOD=6.33;ANN=T|missense_variant|MODERATE|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000377782.7|protein_coding|10/10|c.1270C>A|p.Arg424Ser|1338/1632|1270/1281|424/426||,T|missense_variant|MODERATE|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000356876.7|protein_coding|10/10|c.1243C>A|p.Arg415Ser|1331/1625|1243/1254|415/417||,T|missense_variant|MODERATE|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000351959.9|protein_coding|9/9|c.1132C>A|p.Arg378Ser|1200/1441|1132/1143|378/380||,T|missense_variant|MODERATE|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000348333.7|protein_coding|9/9|c.1108C>A|p.Arg370Ser|1108/1119|1108/1119|370/372||,T|missense_variant|MODERATE|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000351748.7|protein_coding|5/5|c.694C>A|p.Arg232Ser|694/705|694/705|232/234||,T|3_prime_UTR_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000480393.5|nonsense_mediated_decay|9/9|c.*582C>A|||||1463|,T|3_prime_UTR_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000485036.5|nonsense_mediated_decay|9/9|c.*530C>A|||||1215|,T|3_prime_UTR_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000414040.6|nonsense_mediated_decay|9/9|c.*530C>A|||||1215|,T|3_prime_UTR_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000502588.5|nonsense_mediated_decay|7/7|c.*530C>A|||||1215|,T|3_prime_UTR_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000502730.5|nonsense_mediated_decay|5/5|c.*446C>A|||||677|,T|3_prime_UTR_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000510563.5|nonsense_mediated_decay|8/8|c.*530C>A|||||1215|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000377828.5|protein_coding||c.*1299G>T|||||501|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000461727.5|protein_coding||c.*1299G>T|||||516|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000461703.6|processed_transcript||n.*2091C>A|||||2091|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000453341.1|retained_intron||n.*2666C>A|||||2666|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|PLEKHG5|ENSG00000171680|transcript|ENST00000537245.5|protein_coding||c.*6118C>A|||||4647|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000477679.1|retained_intron||n.*1034G>T|||||1034|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000468561.1|processed_transcript||n.*75G>T|||||75|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000453260.6|retained_intron||n.*35C>A|||||35|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|PLEKHG5|ENSG00000171680|transcript|ENST00000489097.5|retained_intron||n.*4647C>A|||||4647|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|PLEKHG5|ENSG00000171680|transcript|ENST00000535355.5|protein_coding||c.*6118C>A|||||4647|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|PLEKHG5|ENSG00000171680|transcript|ENST00000377748.5|protein_coding||c.*6118C>A|||||4647|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000434576.1|protein_coding||c.*260G>T|||||75|WARNING_TRANSCRIPT_NO_START_CODON,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000475730.5|processed_transcript||n.*311C>A|||||311|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000469691.5|retained_intron||n.*549C>A|||||549|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000515145.1|retained_intron||n.*3122C>A|||||3122|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000416731.5|protein_coding||c.*1299G>T|||||1047|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000475228.5|protein_coding||c.*1393G>T|||||1393|WARNING_TRANSCRIPT_INCOMPLETE,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000633239.1|protein_coding||c.*1299G>T|||||519|WARNING_TRANSCRIPT_NO_START_CODON,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000481401.5|protein_coding||c.*1192C>A|||||1192|WARNING_TRANSCRIPT_INCOMPLETE,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|PLEKHG5|ENSG00000171680|transcript|ENST00000400913.5|protein_coding||c.*6118C>A|||||4647|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|PLEKHG5|ENSG00000171680|transcript|ENST00000340850.9|protein_coding||c.*6118C>A|||||4647|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000636330.1|protein_coding||c.*5248G>T|||||4774|,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|ESPN|ENSG00000187017|transcript|ENST00000636644.1|protein_coding||c.*4182G>T|||||4182|WARNING_TRANSCRIPT_INCOMPLETE,T|non_coding_transcript_exon_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000473343.5|retained_intron|4/4|n.1297C>A||||||,T|non_coding_transcript_exon_variant|MODIFIER|TNFRSF25|ENSG00000215788|transcript|ENST00000513135.5|retained_intron|6/6|n.3189C>A||||||  GT:AD:AF:F1R2:F2R1:MBQ:MFRL:MMQ:MPOS:SA_MAP_AF:SA_POST_PROB 0/1:6,2:0.278:3,2:3,0:29,39:204,184:60:14:0.00,0.253,0.250:0.023,0.025,0.952    0/0:9,0:0.126:3,0:6,0:24,0:169,0:0:0

同样是在原来的vcf文件的INFO列添加了许多注释信息，这里仅仅是该样本的第一个vcf突变位点，就注释上了大量的信息，其中一个原始的有多个转录本，这个结果和vep注释后拿到的结果非常相似。

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