扩增子分析解读6进化树,Alpha,Beta多样性
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写在前面
之前发布的《扩增子图表解读》系列，相信关注过我的朋友大部分都看过了(链接直达7月文章目录)。这些内容的最初是写本实验室的学生们学习的材料，加速大家对同行文章的解读能力。
《扩增子分析解读》系列文章介绍
扩增子分析是目前宏基因组研究中最常用的技术，由于微生物组受环境影响大，实验间重复较差，更需要更多的实验重复和分析技术来保证结果的准确性、可重复性。
本系统文章叫分析解读，即有详细的扩增子分析流程代码，又有本人对使用参数、备选参数意义的解读，可以让大部分零基础的人，更好的理解数据分析过程，并可亲自实践在自己的课题上，获得更好、更合理的实验结果。
本文采用目前最主流的扩增子测序数据类型HiSeq2500 PE250类型数据为例，结合目前主流方法QIIME+USearch优点组合定制的分析流程。本课程中所需的测序数据、实验设计和课程分析生成的中间文件，均可以直去百度云下载。链接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d。
本课程代码的运行，至少需要Linux平台+安装QIIME1.9.1，我之前发布过三种安装QIIME的方法详见文章目录，总有一款适合你。
第六节. 进化树,Alpha,Beta多样性
本节课程，需要完成
扩增子分析解读1质控,实验设计,双端序列合并
2提取barcode,质控及样品拆分,切除扩增引物
3格式转换,去冗余,聚类
4去嵌合体,非细菌序列,生成代表性序列和OTU表
4去嵌合体,非细菌序列,生成代表性序列和OTU表
5物种注释,OTU表操作
先看一下扩增子分析的整体流程，从下向上逐层分析。
分析前准备
# 进入工作目录
cd example_PE250上一节回顾：我们的OTU获得了物种注释，并学习OTU表的各种操作————添加信息，格式转换，筛选信息。
接下来我们学习对OTU序列的进化分析、同时计算Alpha和Beta多样性值。
16. 进化树构建
进化树是基于多序列比对的结果，可展示丰富的信息，我们将在R绘图中详细解读。此处只是建树，用于Alpha, Beta多样性分析的输入文件。
# clustalo多序列比对，如果没有请安装Clustal Omega
clustalo -i result/rep_seqs4.fa -o temp/rep_seqs_align.fa --seqtype=DNA --full --force --threads=30
# 筛选结果中保守序列和保守区
filter_alignment.py -i temp/rep_seqs_align.fa -o temp/ # rep_seqs_align_pfiltered.fa, only very short conserved region saved
# 基于fasttree建树
make_phylogeny.py -i temp/rep_seqs_align_pfiltered.fasta -o result/rep_seqs.tree # generate tree by FastTree17. Alpha多样性
Alpha多样性是计算样品内物种组成，包括数量和丰度两维信息。具体解释可见1箱线图：Alpha多样性，老板再也不操心我的文献阅读
Alpha多样性计算前需要对OTU表进行标准化，因为不同测序深度，检测到的物种数量会不同。我们将OTU表重抽样至相同数据量，以公平比较各样品的物种数量。方法如下：
# 查看样品的数据量最小值
biom summarize-table -i result/otu_table4.biom
# 基于最小值进行重抽样标准化
single_rarefaction.py -i result/otu_table4.biom -o temp/otu_table_rare.biom -d 2797
# 计算常用的四种Alpha多样性指数
alpha_diversity.py -i temp/otu_table_rare.biom -o result/alpha.txt -t result/rep_seqs.tree -m shannon,chao1,observed_otus,PD_whole_tree18. Beta多样性
Beta多样性是计算各样品间的相同或不同，OTU表也需要标准化。采用重抽样方法丢失的信息太多，不利于统计。此步我们选择CSS标准化方法。
# CSS标准化OTU表
normalize_table.py -i result/otu_table4.biom -o temp/otu_table_css.biom -a CSS
# 转换标准化OTU表为文本，用于后期绘图
biom convert -i temp/otu_table_css.biom -o result/otu_table_css.txt --table-type="OTU table" --to-tsv
# 删除表格多余信息，方便R读取
sed -i '/# Const/d;s/#OTU //g;s/ID.//g' result/otu_table_css.txt
# 计算Beta多样性
beta_diversity.py -i temp/otu_table_css.biom -o result/beta/ -t result/rep_seqs.tree -m bray_curtis,weighted_unifrac,unweighted_unifrac
# Beta多样性距离文件整理，方便R读取
sed -i 's/^\t//g' result/beta/*写在后面
今天先到这里，本文已经讲了太多了，够大家学习一会的了。要想了解这些程序的更多功能，一定要阅读程序的帮助全文，才能有更深入的理解。
下节预告：7物种分类统计,筛选进化树和其它
Reference
http://www.clustal.org/omega/
http://qiime.org/scripts/filter_alignment.html
http://qiime.org/scripts/make_phylogeny.html
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