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微生物相关网络构建教程:MENA, LSA, SparCC和CoNet

2017-08-30 刘永鑫 宏基因组

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原文为自自Microbial association network construction tutorial http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/index.php

简介Introduction

本文提供MENA, LSA, SparCC和 CoNet四种网络构建方法,作者为CoNet作者。由中科院遗传发育所刘永鑫博士翻译整理,并补充及更新部分程序参数。
说明:计算过程在Ubuntu16.04系统的服务器,没服务器的伙伴可以使用QIIME提供的虚拟机;网络可视化在Win10上安装Cytoscape展示及导出。

必须软件Prerequisites

  • 最新版Windows版 Cytoscape下载并安装  http://www.cytoscape.org/

  • 在Cytoscape的App Manager中安装CoNet和CytoCluster http://systemsbiology.vub.ac.be/conet

  • 注册MENA web server: http://129.15.40.240/mena/

  • 安装LSA http://hallam.microbiology.ubc.ca/fastLSA/install/index.html

    cd /mnt/bai/public/bin wget http://hallam.microbiology.ubc.ca/fastLSA/resources/fastLSALinux.tar.gz tar xvzf fastLSALinux.tar.gz cd fastLSALinux g++ fastLSA.cpp pnorm.cpp lsaPack.cpp thread.cpp lsaParse.cpp -o fastLSA -pthread
  • Spacc安装 https://bitbucket.org/yonatanf/sparcc

    cd /mnt/bai/public/bin wget https://bitbucket.org/yonatanf/sparcc/get/05f4d3f31d77.zip unzip yonatanf-sparcc-05f4d3f31d77.zip mv yonatanf-sparcc-05f4d3f31d77 sparcc
  • 注册在线微生物管理平台Qiita: microbial study management platform https://qiita.ucsd.edu/ # username: woodcorpse@163.com

  • 安装biom: include by QIIME,末安装可先参考安装QIIME

  • 安装R包igraph用于可视化SparCC结果

    sudo R source("https://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite("igraph")

示例数据 Data

Environmental Microbiology 12(11), 2998-3006 (2010).
http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/files.php

# 进入工作目录下载相关文件 cd /mnt/bai/yongxin/test/microbial_network # 下载OTU表 wget http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/documents/arctic_soils.biom # 下载实验设计文件mapping file wget http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/documents/arctic_soils_mapping_file.txt # 转换biom为txt,并带物种信息 biom convert -i arctic_soils.biom -o arctic_soils1.txt --to-tsv --header-key taxonomy # 筛选SampleID和pH值列,并去掉第一行#号 cut -f 1,20 arctic_soils_mapping_file.txt|sed 's/#//g' > arctic_soils_features1.txt # 用qiime script / R过滤OTU表中每行reads count > 20的OTU,并不需要物种信息,作为另三个软件的输入 filter_otus_from_otu_table.py -n 20 -i arctic_soils.biom -o arctic_soils_filter.biom biom convert -i arctic_soils_filter.biom -o arctic_soils_filter.txt --to-tsv ## 或下载转换和筛选好的OTU table和实验设计 # 下载预转换的biom为txt格式,带物种信息,并筛选部分结果及调整格式,conet输入文件,与biom转换的结果一致 wget http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/documents/arctic_soils.txt # 过滤reads count > 20的OTU,且无物种注释,过滤掉的count求和归为summed-nonfeat-rows行。该文件做为其它软件输入 wget http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/documents/arctic_soils_filtered.txt # 过滤的mapping file,对OTU表对应,conet输入 wget http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/microbialnetworks/documents/arctic_soils_features.txt

MENA

http://129.15.40.240/mena/  自己注册个新用户

  • 上传数据:Upload your dataset, arctic_soils_filtered.txt

  • 构建网络:Construct the network, 选择数据submit,参数为1,keep blank, do not take alogarithm,其它为默认,Submit

  • 查看结果:回主界面,点击Search datasets and networks,每个有项目名、参数和最右边有运行状态,done为完成;点结果列表的名字可看结果,选择不同参数构建网络 Constrcut the netowrk;

  • 分析网络:Analyze the networks — Network reports,点击每项按默认参数执行; 如Global Network properties,网络属性,如边、点数据信息;Individual nodes’ centrality为每个点的属性,如node.degree, Clustering.Coefficient;Module Separation and modularity calculation

  • 可视化:分析网络中的可视化,可以在线简单成像,也可下载cytoscape格式sif文件及边点注释文件本地分析;并替换所有_为-,替换np为pp,便于后期与Conet比较

    sed -i 's/_/-/g' * # replace all underscores by dashes in the sif file as well as in the node attribute sed -i 's/np/pp/g' arctic\ 0.540.sif # replace all instances of np by pp in the sif file
  • Cytoscapes分析:打开软件

  1. 打开网络文件 File — Import — Network — File — arctic 0.540.sif;

  2. 打开点属性 File->Import->Table->File — node attribution文件;

  3. 布局设置 Layout->yFiles Layouts->Organic;

  4. 设置颜色 style,在样式右链下前头中选择 new style,输入名字如“mena”,再设置Fill color的Map选项,Column选择No. module按模块编号上色,Mapping type选择Discrete Mapping,再手动调置每一类的颜色。

  5. 导出位图和矢量图;File - Export - Network view as Graph - 分别选择pdf和png保存,png大小为200%,dpi=300;但有时图像尺寸会有问题,需要用AI调整PDF,再输出png或tiff;调整后结果如下:保存至本地。

LSA

LSA是本地相似分析(local similarity analysis)的缩写。主要研究网络在时间序列上的变化。本测试数据没有时间序列,只演示软件使用,详细见文章。

  • 运行程序,计算网络

    /mnt/bai/public/bin/fastLSALinux/fastLSA -i arctic_soils_filtered.txt -o arctic_soils_lsa.txt -d 3 -a 0.01 > lsa.log # d代表时间序列的最大延迟,a代表显著性阈值
  • Cytoscape可视化

  1. 打开arctic_soils_lsa.txt网络文件,选择index1为source node,index2为target node,其它默认为边属性,确定;

  2. 自动调整布局:Layout->yFiles Layouts->Organic

  3. 形状设置:建立LSA样式;我们设置的d延迟有三级,可以选择边Edge的源键头形状Source Arrow Shape的Map属性,Column选择按lag分类,类型为Discrete,再设置各种箭头形状;

  4. 保存session为LSA,导出PDF名为LSA,建议先调整大小显示整个网络,默认输出显示区域;File - Export - Network view as Graph - PDF;再用AI调整大小、位置,最后导出PNG;

SparCC

网络接口工具,对数据组成的的鲁棒性更强(0和极大值处理更好);

# 计算相关系数 Compute correlations python /mnt/bai/public/bin/sparcc/SparCC.py arctic_soils_filtered.txt -i 10 --cor_file=arctic_soils_sparcc.txt > sparcc.log # -i 是迭代次数并求平均 # 重采样 Compute bootstraps python /mnt/bai/public/bin/sparcc/MakeBootstraps.py arctic_soils_filtered.txt -n 100 -t boot_#.txt -p Resamplings/ # 对采样计算相关系数,方法默认SparCC,支持pearson, spearman和kendall mkdir Bootstraps for i in `seq 0 99` do    python /mnt/bai/public/bin/sparcc/SparCC.py Resamplings/boot_$i.txt -i 10 -a SparCC --cor_file=Bootstraps/sim_cor_$i.txt >> sparcc.log done # 计算Pvalue Compute p-values python /mnt/bai/public/bin/sparcc/PseudoPvals.py arctic_soils_sparcc.txt Bootstraps/sim_cor_#.txt 10 -o sparcc_pvals_two_sided.txt -t 'two_sided'  >> sparcc.log

相关系数矩阵结果使用R可视化,本地或Rstudio服务器

setwd("/mnt/bai/yongxin/test/microbial_network/") # load R graph library igraph library(igraph) pvals=read.table("sparcc_pvals_two_sided.txt",header=TRUE,sep="\t") pvals.mat=pvals[,2:ncol(pvals)] # set p-values of 0 to a non-zero, small p-value so we can take the logarithm pvals.mat[pvals.mat==0]=0.000000001 # convert into significance sig.mat=-1*log10(pvals.mat) # remove all edges with significance below 1 sig.mat[sig.mat<1]=0 sig.mat=as.matrix(sig.mat) # convert adjacency matrix into a graph sparcc.graph=graph.adjacency(sig.mat,mode="undirected") # display the graph layout=layout.spring plot(sparcc.graph, layout=layout) # Spring layout was removed, we use Fruchterman-Reingold instead.

CoNet

提供组合式(ensemble-based)的网络构建,例如其结合了多种相似计算方法。组合式方法和重启计算技术可以减少计算偏差,在作者文章中有详细说明 PLoS Computational Biology 8 (7), e1002606。自从作者写了本套教程,CoNet相比其它软件被更广泛的使用。

  1. 基本配置 Basic configuration
    打开Cytoscape,在APPs菜单中选择CoNet插件即可进入程序主界面;可以手动按步配置参数,也可以在参数文件在修改再加载;我选择了后者,参数模板为 conet-permut-settings.txt ,下载后用文本编辑器(如Ultraedit, Editplus)修改,只要个性input,randscorefile和features(1.11中变更为metadata)文件的完整路径和文件名,它们分别为otu-table, 排序输出文件名和属性值(可选),我们这里使用自己实验的文件,或用前目数据准备阶段我们通过原始OTU表和Mapping file筛选的结果文件arctic_soils1.txt和arctic_soils_features1.txt(我计算的输入文件添加了1与作者提供的区别开来,作者提供了输入文件,但是没有提供获得这两个文件的过程,我根据作者描述的过程,设计和shell脚本重现了作者的输入文件方法供参考)。直接用setting load按扭,加载参数文件,并点apply应用即可,并关闭菜单。

  2. 排列 Permutation
    点GO开始计算网络和Paramutation文件(结果为什么没有网络和Paramutation文件也0值,可能是配置文件中输入输出路径或文件名错误,重新检查并加载或手动选择输入输出文件),成功会生成有点边网络数据,如果图像不可见,可以个性样式style和布局Layout-YFile Layout-Organic显示出来。保存新版1.1.1参数(作者1.0b4版本差别较大,如参数名feature更为metadata,文件只有名没有路径)至文件conet-permut.cfg。生成了252个点,9741个边的网络;

  3. 重抽样Bootstrapping
    下载conet-boot-settings.txt修改方法同permut,加载,运行,另存配置conet-boot.cfg。生成了204个点,1719个边的网络;

  4. 从随机文件恢复网络Restore network from random files
    下载 conet-restore-settings.txt修改方法同permut,加载,运行,另存1.11配置conet-restore.cfg。生成了199个点,1721个边的网络;

  5. 可视化Visualization
    Layout->yFiles Layouts->Organic,自动布局;CoNet使用的样式是软件自定义的cooccurrence_0,正负相关分别为绿和红;可以按Column选项中的分类学kindom, class, family, genus、丰度abundance、点的连线度degree、标签label上色,如Node - Fill Color - Map - Column(选择分类学纲上色class) - Map type (非连续颜色Discrete Mapping) - 手动选择每一种class的颜色。
    保存session为conet,导出PDF名为conet,建议先调整大小显示整个网络,默认输出显示区域;File - Export - Network view as Graph - PDF;再用AI调整大小、位置,最后导出PNG;

网络分析 Network analysis

  1. 比较Conet与MENA的一致性
    保存Conet为sif格式:File - Export - NetWork - conetNetwork.sif;
    修改其格式与MENA一致便于比较:用Editplus打开conetNetwork.sif,用正则表达式替换\t\t为\tpp\t;
    使用Cytoscape打开:Import - Network - File打开,
    比较点和边:Tools - Merge - 选择两网络添加至右边,选择Intersect,再点Merge; 看到只有62个点和16条边重合,重合的边极少?

  2. 全局网络分析 Global network analysis
    Tools->Network Analyzer->Network Analysis->Analyze network,选择默认的无向网络undirected,确定,可获得网络的属性的面板,包括网络参数、密度、样式路径长度和簇系数、节点度分布、节点特异属性(such as 离心率eccentricity and 中介中心性betweenness centrality)

  3. 中心节点Hub nodes
    分析后的网络点有很多属性,按degree排序即可找到中心节点,本数据为Acidobacteria。

  4. 网络聚类Network clustering
    基因表达网络中,簇用来预测未知功能的基因,与表达相似基因功能相近。微生物相关网络可以发现相似的生活方式。
    先选择正相关的边:从Cytoscape选择,没成功;CoNet输出的为正相关网络,方法链接也没説具体操作;
    打开Apps - CytoCluster,选择 OH-PIN algorithm ,点Analyze current network。结果显示在另一个面板上,有一些clusters,按由大到小排列。比如我们想分析第一个cluster的物种属性,选择cluster1,点Creat sub-network,可查看该子网按之前物种颜色分类的结果。

  5. 联合环境因素分析  Neighbors of environmental parameter
    选择pH点(没找到?),再点邻近的点,可找到相pH正或负相关的OTU

结论 Conclusions

  1. 网络是精糙无标度(适应结点度分布的权力法则)和小世界(路径长度短特点);

  2. 如果只看正相关边,网络分为两个主要的簇,由不同的分类学群主载;

  3. 如果看pH值的邻近节点,发现两个负相关的簇:一个与pH正相关,另一个相反;
    对于生物学观点,全局网络属性意义不大。然而,网络形成两个物种分类学特异的簇,暗示苔原土壤存在两个不同的微生物群落。人类也观察到在肠道和阴道中有明显不同的微生物群落。可变的微生物群落是有争意的,因为不清楚群落是否真的不同,还是梯度的渐变。我们可以接受这两种差点,因为有一些部分是重叠的。
    当探索临近的pH结点,我们看到Solibacteres和Acidobacteria在其中一个正相关簇中占主导,并与pH呈负相,意味着它们喜欢酸性环境。我们看到另一个簇中Chloracidobacteria和Alphaproteobacteria占主导,且与pH正相关。这些微生物更喜欢基础环境。
    结论是土壤pH驱动微生物群落改变。与数据原文结论一致。
    此外,我们还发现了更细分类单元与pH的相关性。如Acidobacteria门中的Chloracidobacteria纲与pH正相关,是该门中的特异的纲。结果可以根据pH反苔原土壤中的主要细菌门类。

名词解释 Resources

  1. CoNet无向网络:为什么CoNet返回的是无向网络用于选择配置。答案是所有5个选择相似、不相似和相关测量是不对称的,相似的A与B与B与A是相同的。

  2. CoNet和Cytoscape中心节点的检测:找有最多正或负相关边的节点,在Node table中,点Degree即按其排序,找到最多度的点。

  3. 从随机千分文件中恢复CoNet网络 Restore the CoNet network from random score files:为了基于之前计算好的permutations and bootstraps文件而生成网络。

  4. 正相关边的聚类:为什么只聚类正相关的边,因为我们感兴趣在一起的物种共有一些特征。大部分聚类算法不能区分正或负相关的边,负相关的也会聚类在一起。

  5. Cytoscape中选择正相关边:Select -> Use filter(找不到?), choose “edge.interactionType” as column and click “Add”. Select “copresence” and click “Apply Filter”. Go to Select -> Nodes and click “Nodes connected by selected edges”. Go to File -> New -> Network and click “From selected nodes, selected edges”. Finally, layout the network (e.g. Layout->yFiles Layouts-> Organic).

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