案例丨干细胞移植对帕金森病的8例临床试验效果评估
帕金森病主要表现为震颤、强直、运动迟缓和体位不稳。传统的药物治疗和外科手术治疗均不能逆转神经变性，不能重新增加多巴胺能神经细胞的数目。相反由于多巴的神经毒性、电极刺激还会使神经元数目进一步减少，因此寻求一种从病因上提高神经系统细胞数目的治疗具有重要意义。
传统观点认为，中枢神经系统的神经细胞是一种终末细胞，任何病理过程导致的神经元丢失是一个不可逆过程。然而，近年来对成体干细胞多向分化潜能的深入研究，为帕金森病的治疗提供了新思路和方法。
实验采用脐带间充质干细胞移植治疗帕金森病患者，观察脐带间充质干细胞移植改善帕金森病神经功能的效果。
1、对象和方法
设计：自身对照开放性临床试验。
时间及地点：病例来自2010-08/11上海455医院干细胞移植中心。
对象：选择上海455医院干细胞移植中心收治的帕金森病患者8例，符合2006年中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病组制定的诊断标准，男4例，女4例，年龄50~78岁，平均年龄58岁，Hoehn-Yahr分级为Ⅲ~Ⅴ级。患者对治疗均签署知情同意书，治疗方案经医院医学伦理委员会批准。
干细胞移植相对禁忌证：①高度过敏体质或者有严重过敏史者。②合并恶性肿瘤。③全身感染或局部严重感染。④并发心、肺、肝、肾等重要脏器的功能障碍。⑤凝血功能障碍，如血友病。⑥血清学检查阳性者，如艾滋病、乙肝、梅毒等。8例患者一般资料见表1。
技术路线：
脐带间充质干细胞制备及鉴定：
①在产妇知情同意情况下，通过伦理委员会批准，获取正常供者(足月妊娠的产妇)来源的脐带，无菌收集脐带，浸没于含1%双抗(青链霉素)的PBS中，玻璃容器密封送回实验室。
②超净台上剪取约2cm长的脐带，剖开动静脉，用PBS洗净血污。
③将脐带剪碎成肉糜状，转移到离心管中，加入4mL的消化液(含0.25%胰酶，200~400U胶原酶Ⅱ/L的PBS)，混匀，37℃中消化4h，每隔10min振摇1次。
④吸取消化上清，转移到25cm2细胞培养瓶中，加入DMEM/F12培养基(含体积分数为10%~15%胎牛血清)，37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。
⑤约3d能在显微镜下观察到贴壁细胞，半量换液后继续培养，3d后换液，细胞已经能稳定生长。每3d换液1次，至细胞生长铺满瓶底(约10d)，即可进行传代。
⑥用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29，CD34，CD45，CD44，CD90，CD105的表达率。其中CD29，CD44,CD90，CD105的阳性率均在95%以上，CD34，CD45表达阴性。
临床检查：所有患者均住院治疗，第1周进行常规检查，8例患者血、尿、便常规、肝肾功能、多项肿瘤标记物、胸片等均正常。
脐带间充质干细胞的移植：自第2周起患者应用脐带间充质干细胞进行颈动脉穿刺移植治疗。在进行穿刺时，首先要帮患者选择好正确的体位，一般采用平卧位，将枕头垫于颈下(高8~10cm)，头向后仰，尽量暴露颈部(致使颈部皮肤绷紧以利于穿刺)，头略偏向于穿刺部位的对侧(以偏离正中线1.0~2.0cm为宜)，术者站于患者的右侧进行操作。
根据解剖位置(上至甲状软骨上缘，下至甲状软骨下缘1cm处)寻找正确的注射部位，进行常规的皮肤消毒后，用左手食指或食指、中指固定其搏动明显处的血管，右手食指和拇指固定准针柄部位进行垂直进针，见回血，表明穿刺成功。
进针时要注意进针方向，其垂直角度以与颈动脉垂直方向为准，而非与水平面垂直。缓慢注入(在10min内)脐带间充质干细胞注射液20mL(干细胞数4×107)，1次/周，1次为1个疗程，视疗效共治疗1或2个疗程。
辅助治疗：常规给予扩张血管、抗自由基、营养神经、稳定细胞膜等治疗。
评估标准：分别于移植前和移植后1个月，采用帕金森病统一评分量表(UPDRS)对患者进行评定，主要从4个方面进行评价：第1部分：精神、行为和情绪；第2部分：日常活动；第3部分：运动功能；第4部分：治疗的并发症。分值越高表示神经功能缺损越严重。
主要观察指标：移植前后患者自身UPDRS评分的变化。
统计学分析：由第一作者采用SPSS16.0软件完成统计处理，计量资料以`x±s表示，数据行配对t检验分析，P<0.05为差异有显著性意义。
2、结果
2.1参与者数量分析 8例患者均成功移植，中途无脱落，按意向性进行结果分析。
2.2脐带间充质干细胞移植后1个月患者UPDRS评分的变化 8例患者移植前UPDRS评分平均(89.38±30.92)分，移植后平均(75.63±27.07)分，差异有显著性意义(P<0.05)，见表2。主要集中在对肌强直、震颤的改善。
2.3并发症和不良反应 移植过程中及移植后患者的生命体征均平稳，移植后患者均有不同程度的乏力症状，1例患者出现兴奋症状，1例患者出现移植后低热，体温不超过38℃，对症处理后均完全缓解。8例患者均未出现移植物抗宿主病。
3、讨论
帕金森病是一种以中脑黑质纹状体系统的多巴胺能神经元变性，导致分泌的多巴胺递质降低，引起静止震颤，四肢僵硬、运动迟缓及体位不稳为主的锥体外系疾病，目前临床以药物治疗和手术治疗为主。
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不论是递质替代还是外科手术均不能改善脑内环境，不能增加多巴胺能神经元的数目，相反由于多巴的神经毒性、电极的刺激还会使神经细胞的数目进一步减少，因此寻求一种从病因上提高神经系统细胞数目的治疗具有重要意义。
3.1 干细胞治疗的优势 ：传统观点认为，中枢神经系统的神经细胞是一种终末细胞，创伤、中毒、缺血缺氧等病理过程引起的神经元丢失是一个不可逆的过程。成体干细胞横向分化的多潜能性为帕金森病的治疗提供了新思路。
干细胞治疗是基于以下理由：首先通过干细胞移植替代多巴胺能神经元的丢失(这代表着帕金森病的核心病理)，这些替代的干细胞将不会经历引起帕金森病的同一病程；其次这些细胞能持续产生和释放多巴胺多年。
事实上，胚胎多巴胺能神经元移植后可以存活超过10年，尽管证据显示，患者本身的多巴胺系统持续退化。此外，50%黑质多巴胺能细胞损失以及纹状体大于50%多巴胺能神经支配的减少，是产生帕金森氏症临床特征所必需的。
因此，任何细胞疗法只需要还原黑质纹状体系统恢复到正常的50%，即可认为它是有效的。近年来通过移植神经干细胞治疗帕金森病已经成为当前研究的热点，但成人神经干细胞并不容易获得。
胚胎的多巴胺能神经元移植可以减轻帕金森病动物模型的行为学缺失，但存在伦理学问题，因此探索神经细胞的其他组织来源成为重要问题。
任何旨在修复帕金森病黑质多巴胺能通道的细胞疗法必须能够达到：①移植后细胞的长期生存(以年计)。②分化成足够数量黑质多巴胺能神经元，并释放多巴胺。③安全可靠，没有证据显示肿瘤的形成，或分化的神经元/细胞进一步破坏黑质纹状体通路。④不需要长期使用免疫抑制剂。
3.2 细胞来源的选择 间充质干细胞具备上述特性，除此还具备以下优势：①取材方便，细胞来源充足。除脐带外，骨髓、脐血等组织也存在间充质干细胞。②在一定培养条件下，可短期内大量扩增。③能透过血脑屏障。④避免了伦理道德上的争议；决定了它可以作为移植治疗帕金森病的理想种子细胞。而脐带间充质干细胞是目前使用最为成熟的一种间充质干细胞。
3.3 移植途径的选择 文献报道的途径包括：经壳核移植、经侧脑室移植、腰穿+鞘注、静脉通道。前两种方法集中应用于人胚胎脑组织移植的临床试验。本中心首次尝试经颈动脉穿刺后输注干细胞。
此途径的选择主要考虑：①黑质纹状体区由颈动脉供血。②动脉途径较静脉途径可以减少干细胞在静脉窦处的栓塞损失。③经动脉途径输注，干细胞分布均匀，不会形成移植后再生“热点”(hotspot，与移植后最棘手的并发症“关”期运动障碍相关)，从而有效减少移植后并发症的发生。
3.4 颈动脉注射过程中的注意事项 颈动脉注射过程中有许多注意事项，主要包括以下方面：
①进针操作前，取得患者配合，消除其紧张和焦虑情绪，并嘱咐在穿刺成功后尽量避免咳嗽及吞咽动作。
②穿刺过程中，尽量做到一次成功，避免多次穿刺造成颈部损伤。
③拔针后按压穿刺点5~10min，并注意按压位置正确，以免按压到颈动脉窦和颈动脉小球引起一系列不良后果。只有了解了颈动脉的位置、掌握操作方法及其注意事项，才能在实际工作中提高穿刺的成功率，减轻患者痛苦。
3.5 干细胞替代疗法的可能作用机制 目前的研究认为间充质干细胞治疗帕金森病的可能机制有：
①间充质干细胞移植入脑后，能形成表达神经标志性蛋白如nestin的神经元样细胞(neuron-like cells)或星形胶质细胞，产生的细胞可在受损部位周围存活甚至移行至全脑。
②间充质干细胞在中枢神经系统Niche下能分泌脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子等营养因子，或者刺激损伤部位产生内源性生长因子，促进损伤组织的修复并减少细胞凋亡。
③间充质干细胞是受损部位新生血管的主要组成细胞，可分化成血管内皮细胞和细胞外基质，帮助神经保护、促进血管新生。
④在脑内创造适宜的局部微环境，通过体外扩增或不同因子诱导分化的方法使间充质干细胞分化为神经细胞后进行移植，替代受损细胞重建神经功能区和传导通路。本中心的临床结果表明，脐带间充质干细胞移植治疗，在短期内能部分改善帕金森患者的震颤、强直，但未观察到对运动迟缓、体位不稳等症的有效改善。
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其原因主要考虑观察期短，干细胞进入颅内后最大作用的发挥是一个长期过程。故拟在随访期内对患者症状的改善作一追踪，要求患者定期复诊，除UPDRS量表评分外，可结合PET显像示氟多巴的摄取有无增加，对疗效进行客观评定。
与现有的医疗和手术治疗的帕金森病相比，干细胞疗法代表一种进步的治疗方案，已成为临床上具有竞争力的新疗法，现有研究表明其能促使长期持久地，大幅改善运动障碍，阻断疾病进程。
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