人脐带间充质干细胞治疗慢加急性肝衰竭患者的初步临床观察
慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liverfailure，ACLF）是我国最常见的肝衰竭类型，其中绝大部分病因为乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染，病情危重，病死率高，内科保守治疗效果不明显，外科肝移植是唯一有效的救治手段，但由于肝源有限、花费高以及术后需要长期服用抗排异药物等原因，许多ACLF患者未能进行肝移植治疗。因此，需要迫切寻求能治疗并延长ACLF患者生存时间的治疗方法。
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群来源于中胚层的成体干细胞，主要来源于骨髓、肝脏、脐带、脐血等组织，具有自我更新、跨胚层多向分化和免疫调节等功能。
移植MSC可随血流来到肝脏，附着于血管内皮细胞，渗出血管后植入肝实质，在损伤肝脏微环境作用下分化为肝细胞样细胞。目前已有MSC移植治疗肝衰竭的报道，但是这些研究缺乏长期对照以明确其安全性和有效性。
近年来，脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，UC-MSC）因其取材方便、扩增简便、无伦理学限制和病毒感染风险而备受关注。本实验从健康脐带组织内分离出MSC，对其形态、表型、分化三方面鉴定后，通过外周静脉回输给ACLF患者；
对照组给予生理盐水回输，测定不同时间点两组生化学指标、终末期肝病评分模型（the model of end-stage liver disease, MELD）及生存时间，进而评价UC-MSC回输对ACLF患者的安全性及临床疗效。
资料与方法
一、临床资料
入组解放军第三〇二医院肝病生物治疗研究中心2009年10月至2013年5月收治的58例HBV感染基础上ACLF患者，临床诊断符合2009年亚太肝病学会（APASL）发布的慢加急性肝衰竭指南。即慢性肝病基础上急性发病，4周之内达到肝衰竭的诊断标准。
即总胆红素（TBil）≥ 5×ULN、凝血酶原活动度（prothrombin activity, PTA）<40﹪或INR≥1.5。所有患者平行对照分组，治疗组31例患者接受UC-MSC外周静脉回输，对照组27例患者给予0.9﹪氯化钠溶液，两组均行综合内科治疗（本项目临床批准号：卫医疗[2009]64号、美国临床试验注册号NCT01218464）。
患者签署《UC-MSC回输知情同意书》。纳入标准：年龄18~65岁，性别不限，所有病例HBs Ag阳性，排除甲型肝炎病毒（hepatitis A virus, HAV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus, HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）及EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）、巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiencyvirus, HIV）重叠感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、恶性肿瘤及妊娠患者。治疗及随访期间患者如行肝移植治疗均按死亡数据统计。
二、UC-MSC制备
脐带取自健康足月胎儿，获产妇同意及伦理委员会批准。采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离细胞，贴壁培养分离纯化，并从形态、表型及分化潜能三方面鉴定UC-MSC。
三、细胞回输
采用单盲法、经前臂静脉回输细胞。治疗组患者回输UC-MSC数量为（0.5~1.0）×106/kg体重，总体积60ml，对照组为等体积0.9﹪氯化钠溶液，每周1次，共回输3次。输注前滴注10﹪葡萄糖酸钙20ml。
四、临床疗效评估
细胞回输后不同时间点（0周、4周、8周和12周）检测生化及相关指标：丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、总胆红素（total bilirubin, TBil）、白蛋白（albumin, ALB）、PTA、血小板（platelet，PLT）、HBV、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、国际标准化比值（international normalizedratio, INR）、血清Cr和MELD评分。
MELD分值=3.8×ln[血清胆红素（μ mol/L）]×0.059+11.2×ln（INR）+9.6×ln[血清肌酐(μ mol/L)]×0.0113+6.4×（病因：胆汁淤积或酒精性为0，其他为1）。
五、统计学分析方法
采用SPSS17.0软件分析，数据以`x± s表示，组间年龄、生化学指标及MELD评分比较采用非参数Mann-Whitney U检验，性别和HBV、DNA数值比较采用卡方检验，生存情况采用Kaplan-Meier分析曲线，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、基线特征比较
对两组ACLF患者的年龄、性别、病毒复制、生化学指标及MELD评分方面进行比较，结果两组患者基线特征基本一致（P>0.05，表1）。
二、安全性分析
UC-MSC的安全性是干细胞临床治疗最优先关注的问题，本研究进行了为期48周的随访。在治疗及随访过程中重点监测了患者生化学指标及肝脏影像学的变化。发现输入UC-MSC后有2例患者出现自限性发热（体温，37℃~38℃），未予特殊处理，2~6h后体温自行恢复正常。
对照组中患者在治疗期间无发热等情况出现。随访48周，UC-MSC治疗组患者未出现明显不良反应。通过检测患者AFP水平及肝脏影像学检查，两组患者均未发现肝脏恶性肿瘤。初步结果显示ACLF患者接受UC-MSC治疗是安全的。
三、生化学指标及MELD评分情况
本研究分析了患者在0周、4周、8周及12周的ALT、TBil、ALB、PTA和MELD评分的变化，结果表明治疗组与对照组均无明显统计学差异（P>0.05，表2~4）。
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四、随访48周患者生存情况分析
随访至48周时，治疗组中生存人数21例，死亡人数7例，其中死亡原因为肝性脑病的5例，上消化道出血导致的失血性休克的1例，感染性休克1例，肝移植人数3例；对照组中生存人数11例，死亡人数15例，其中死亡原因为肝性脑病的9例，上消化道出血导致的失血性休克的3例，感染性休克3例，肝移植人数1例，两组生存率差异有统计学意义（P<0.05，图1
讨论
ACLF发病机制复杂，特点是在慢性肝病基础上短时间内出现大量肝细胞的坏死和肝功能的急剧恶化，临床上表现为以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主的一组症候群。
病情进展至肝衰竭时，短期病死率高达50%~70%，目前内科治疗方法有限。干细胞移植可以提供大量的肝细胞样细胞，替代正常肝脏所需的合成和代谢功能，同时通过旁分泌机制改变组织微环境。
因此，众多研究认为对于终末期肝病患者而言，干细胞疗法可能会成为一种新的治疗手段。已有研究显示，使用骨髓MSC治疗肝硬化和肝衰竭的患者是安全可行的。
笔者既往的试验研究也发现UC-MSC治疗失代偿期肝硬化患者是有效和安全的。本研究显示通过外周静脉输入UC-MSC治疗ACLF患者是安全的，患者除一过性发热的临床表现外，无其他明显不适。
基础研究通过体外长期培养发现MSC自发转化为肿瘤细胞的几率很低，只有超长时间的连续培养后，才会发生少量细胞癌变。既往有报道认为MSC可通过直接转化、抑制抗肿瘤免疫反应和对肿瘤细胞的营养作用等导致肿瘤发生，这可能与Wnt信号有关。
但本研究中，两组ACLF患者在随访48周均未发生肝癌等恶性肿瘤病变，进一步说明UC-MSC治疗的安全性。
前期研究表明UC-MSC输注可改善人和大鼠的肝脏纤维化。笔者既往的研究发现，UC-MSC治疗可以改善失代偿期肝硬化患者的肝功能指标，有效改善失代偿期肝硬化患者的预后。
但其机制并不完全清楚，可能与UC-MSC分泌大量肝细胞生长因子，促进肝细胞增殖有关。同时与UC-MSC分泌多种生物活性分子如生长因子和细胞因子等维护肝脏微环境、参与肝脏功能改善等密不可分。
在本研究中，治疗4周、8周及12周时，两组生化学指标及MELD评分无明显差异，笔者认为出现上述结果的主要原因在于ACLF患者短期内死亡率较高，从生存曲线中可以看到随访期间两组死亡患者大多出现在8周内。
近期研究发现，因为不能及时进行早期肝移植治疗，60%的ACLF患者死于各种相关并发症，如肝性脑病、感染性休克、失血性休克等，3个月内死亡率高达55.7%，这与对照组的死亡率基本一致。
所以在4周、8周、12周时，只有存活的患者才有相应数据，从而两组生化学指标无明显差异，但随访48周的结果表明，UC-MSC治疗组的患者生存率明显高于对照组，说明对于ACLF患者而言，UC-MSC治疗有利于患者肝功能的恢复，有效提高了患者的生存率。当然，因为本研究样本量有限，上述结论仍需要大样本实验进一步验证。
总之，该研究表明通过外周静脉输入UC-MSC治疗ACLF患者是安全有效的，能够改善患者的长期生存时间。但由于本试验治疗组与对照组病例数量均较少，进一步明确临床疗效和不良反应仍有待于深入观察。
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