光片技术小课堂 —— 样本的放置

上一次锘海光片技术小课堂简单介绍了光片显微镜的构建与实现，这次将会继续往下介绍样本的放置。

3.样本的放置

无论某种显微镜技术有多强大，它只有在与生物样本兼容时才能发挥用途，因此样本的放置至关重要。在光片显微技术中，由于样本大小通常比传统样本要大许多，所以样本的放置与传统显微镜所用的碟形或载玻片会有些不同，甚至有时会是垂直定向的放置方式。此外，放置的样品需要在整个成像过程中不发生形变，以便对获得的数据进行完整的三维还原。因此，各种光片显微技术的研发人员们专门为各种光片显微镜的成像以及为特定的样品和生物学问题开发了不同的样本放置方式。比如活体样本通常被浸泡在适合特定生物体的水介质中，而透明化的样本将浸没在透明液中，从成像仓外部进行照明和成像。

3.1

   固体胶筒  

对于一些比较小的活体样本来说，在玻璃毛细管中使用低熔点琼脂糖进行固定是一种比较好的办法。在这个方法中，样本被放入一个充满固体琼脂糖的圆筒中，琼脂糖被挤出到充满培养基的腔室中。透明琼脂糖与水（折射率1.33）和生物组织的折射率相匹配，1.0-1.5%的浓度提供足够的机械稳定性，以重复移动样品，并且玻璃毛细管可重复使用，易于操作。在液体琼脂糖中可以很容易地添加和分散多视图重建用的珠子等基准标记物，在固体琼脂糖柱内均匀分布（图3-1）。对于特定的模型系统和样本尺寸可以选择不同尺寸的毛细管。这种方法对斑马鱼和果蝇胚胎等小型样本很有效，类似尺寸的样本包裹在琼脂糖中是进行快速成像的理想选择，因为样品固定得很好。

图 3-1 样本放置 此图用斑马鱼胚胎作为活体及生长生物样本的例子（A）对于时间较短的实验，样本被包裹在含有固体琼脂糖的玻璃毛细管中；（B）另外也可用FEP管代替玻璃毛细管来封装琼脂糖，相比玻璃毛细管，FEP管可以提升一些样本放置的整体稳定性。

3.2

  悬挂放置  

对于大一点的样本，部分光片显微系统选择了悬挂的方法来放置样本。在这个方法中，样本被悬挂在一个特殊的装置（图3-2）上再浸入装满与样本折射率相匹配的液体的成像仓中。该方法比较适合对样本进行旋转，但在对样本进行平移时比较容易产生形变，并且该方法本身就会由于重力而对样本产生形变，只适合大样本中相对较轻较小且较硬的样本。

图 3-2 悬挂放置（A）用于悬挂方式的特殊装置；（B）样本放置后的实际情况，可以明显看出由重力导致的样本形变问题。

3.3

  托举放置  

对于更大的样本，一些光片显微系统选择了托举的方法来放置样本。在这个方法中，样本通过不同的辅助固定方式（粘胶、夹持、包埋及扎针等）被托举在特别设计的样品架上并浸入装满与样本折射率相匹配的液体的成像仓中。该方法不适合进行旋转，但对样本进行平移位移时会更加稳定，非常适合分区域成像而非旋转成像的光片显微系统。

图 3-3 托举放置针对托举放置设计的样品架（A）使用前后两片可移动的铁片夹持作为辅助固定方式；（B）样品架背面用于连接位移台的固定磁铁；（C）在通过底部磁铁固定的铁片上用粘胶辅助固定样本，并且铁片上还有爪形设计固定样本形态；（D）使用细铁针扎入样本后吸在底部磁铁上作为辅助固定方法。

托举放置由于辅助固定方式的多样性，可以适用的样本范围非常广，比如较硬较大的样本可以直接使用夹持法固定样本，又比如上文提及的斑马鱼等相对较小的样本可以通过琼脂糖包埋后再使用粘胶法固定在样品架上。托举放置由于其本身受重力影响较小的特性更适用于大样本的光片显微成像，并且在使用合适的辅助固定方法后也可较好地兼容相对较小的样本，是非常好的一种固定方式。

参考文献：

1. Kaufmann, A., Mickoleit, M.,Weber, M., & Huisken, J. (2012). Multilayer mounting enables long-termimaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development, 139 (17) , 3242–3247.  http://dx.doi.org/10.1242/dev.082586.

2. Reynaud, E. G., Krzic, U.,Greger, K., & Stelzer, E. H. K. (2008). Light sheet-based fluorescencemicroscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal,2(5), 266–275. http://dx.doi.org/10.2976/1.2974980.

3. Keller, P. J., Pampaloni, F.,& Stelzer, E. H. (2006). Life sciences require the third dimension. CurrentOpinion in Cell Biology, 18(1), 117–124. http://dx.doi.org/10.1016/j.ceb.2005.12.012.

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