JMC | 意大利-美国联合团队虚拟筛选发现全新广谱抗菌拓扑异构酶抑制剂
先睹为快
靶点
DNA解旋酶（DNAgyrase），拓扑异构酶IV（topoisomerase IV）
筛选化合物库
商业数据库，公司内部数据库共30000化合物
计算方法
分子对接，药效团筛选，三维形状相似度，分子动力学模拟
计算软件
Glide，Phase，Desmond
单位
意大利Angelini公司研发中心，美国薛定谔(Schrödinger)公司
发表杂志
Journal of Medicinal Chemistry
背景
耐药细菌，甚至是“超级细菌”的泛滥，给全球健康带来了沉重的负担。在与其斗争的过程中，科研人员不仅需要发现新型有效的抗生素，还需要从耐药机制入手研发新的抗菌化合物，以减少出现耐药性的可能性，提高抵抗持续感染的活性，并提高安全性。在所有经过临床验证的靶标中，细菌IIA型拓扑异构酶家族的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV引起了科研界极大的关注。氟喹诺酮类药物经充分验证且作为治疗细菌感染的一线药物已有50多年历史，但最近累积的突变使细菌对这类疗法产生了耐药性。于是一些制药公司转而开发非氟喹诺酮的新型细菌IIA型拓扑异构酶抑制剂（NBTI）且于2010年公布了NBTI与金黄色葡萄球菌DNA促旋酶的作用机制，但NBTI与其他细菌的DNA促旋酶及拓扑异构酶的结合方式尚不清楚。考虑到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的IIA型拓扑异构酶有较高的序列同一性，且多靶点配体在抗菌研究中有延迟耐药性发生时间及获得比单靶标剂更长寿命的优点，开发同时结合来自不同微生物种的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV的小分子具有重要的广谱抗菌治疗前景。
虚拟筛选
意大利罗马Angelini实验室联合Schrödinger公司的科学家收集了现有NBTI的数据库，商业库和企业库中的3万种化合物，首先用44个NBTI及Schrödinger的decoy数据集与唯一可用的NBTI和金黄色葡萄球菌DNA促旋酶的3D共晶结构（PDB code: 2XCS）对接以测试该晶体结构富集NBTI的能力，保证了结合模式上的整体相似性。然后通过基于结构的虚拟筛选，基于已知NBTI构建药效团模型进行的虚拟筛选以及基于NBTI形状的虚拟筛选共得到900个hits。NBTI由三个结构基序组成：（i）左侧的不饱和杂环（LHS），（ii）右侧的单环或双环（RHS），（iii）主要是脂肪族的连接基团。成功的药效团模型应该具有5个特征：两个氢键受体（A），一个环（R）模拟与DNA的相互作用，一个描述与Asp83相互作用的氢键供体（D）或者极性基团（P），一个芳香或者疏水环（R）代表位于蛋白质内部的疏水基团。
图1. 化合物筛选优化流程(A)及NBTI结构组成(B)
图片来源JMC
结构优化
从虚拟筛选得到的900个hits中选择162个针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV进行酶活性实验筛选。发现12种化合物在超螺旋和脱机测定中能抑制一种或两种酶，化合物ID-130和ID-46对金黄色葡萄球菌的DNA促旋酶和拓扑结构酶IV的IC50在分别在30和500μM级别，产生了双重抑制作用，且ID-130对两种大肠杆菌均具有抗菌活性。通过将ID-130与金黄色葡萄球菌DNA促旋酶共结晶，通过X射线晶体学分析确认了化合物与公开发表的NBTI有类似的与靶标结合的构象，晶体结构甚至保留了药效团建模时的相互作用。
图2. 化合物1的设计思路(A)及ID-130-金黄色葡萄球菌拓扑异构酶IV复合物晶体结构(B)
图片来源JMC
基于ID-130和ID-46，设计出了化合物1，对金黄色葡萄球菌的拓扑异构酶IV的IC50达到了90μM，对其他三种酶的抑制活性在0.5-14μM。显示出良好的多靶点特征且证实了应用合并策略的价值。对1的LHS,RHS和连接基团的构效关系研究（SAR）发现化合物(±)-33,(±)-35,和(±)-36可以有效靶向待测细菌菌株中的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV，而氟喹诺酮类药物优先靶向革兰氏阴性菌中的DNA促旋酶和革兰氏阳性菌中的拓扑异构酶IV。上述三个化合物比氟喹诺酮类化合物具有独特的作用机理和更平衡的活性。
图3.MD模拟化合物35与金黄色葡萄球菌DNA促旋酶的蛋白-配体相互作用
图片来源JMC
计算流程
第一轮对筛选库中3万化合物用Glide进行虚拟筛选，晶体结构选择金黄色葡萄球菌的DNA促旋酶结构与GSK299423的复合物（PDB code：2XCS）。通过目测检查与结合位点的关键相互作用以及对接分数，选择与中间的氨基有相互作用且docking score≤-7.00 kcal/mol的500个化合物。为了避免只用一个晶体结构带来的计算偏差，从文献中选择了8个NBTI，用Schrödinger的Phase程序对其进行仔细评估，生成了两个基于已知NBTI结构的药效团模型，用这两个模型对3万化合物库进行第二轮筛选，得到了约200个全部符合药效团特征的化合物。第三轮筛选采用Phase程序的phase_shape组件对化合物库进行基于形状的筛选，考虑了两种基于形状的筛选方法：基于药效团的和基于原子类型的形状筛选，观察到重叠程度最高的数据集的前2%中存在大量的活性化合物，此轮筛选出大约200个化合物。将三轮筛选得到的900种化合物进行聚类分析以获得化合物的高多样性，去掉冗余，最终选择了162种化合物。为了评估溶剂对化合物1及经SAR优化后的化合物与靶点结合亲和力的贡献，使用了Schrödinger的WaterMap程序研究溶剂化效应和去溶剂化对结合能的影响，查明复合物中水分子的热力学性质。对于Linker处结构修饰的研究，将准备好的复合物转化为完全溶剂化的系统，使用Desmond系统进行分子动力学模拟以捕获离散水对化合物与关键残基Asp83相互作用的贡献。
总结
本文利用基于结构和基于药效团和形状虚拟筛选手段，筛选了30000种化合物的库，鉴定了适合优化的不同于氟喹诺酮类化合物作用机理的两个化合物系列。通过解析与金黄色葡萄球菌DNA促旋酶结合的晶体结构验证了模型有效性。运用构效关系研究进行结构优化，得到了3个具有多靶点活性的NBTI，对代表性革兰氏阴性和阳性病原体及抗性菌株表现出优异的功效，可为将来开发抗感染药物奠定基础。
参考文献:
Magaro G, Prati F, Garofalo B, et al. Virtual Screening Approach and Investigation of Structure-Activity Relationships To Discover Novel Bacterial Topoisomerase Inhibitors Targeting Gram-Positive and Gram-Negative Pathogens. J Med Chem 2019;62:7445-7472
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