空间转录组第二讲：Space Ranger的使用

10x Genomics在分析软件这一块还是非常给力的，开发的每个软件都非常好用而且操作简单，特别是安装方便，基本解压后就能用。对于10x的空间转录组数据主要用10x自己开发的Space Ranger来进行前期的处理。

软件下载地址：

https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest

可以直接点击下载，也可以用下面的curl或wget命令下载。

基因组下载：

在前面同一个页面往下拉就能看到。

10x提供了专门的用于空间转录组分析的基因组，目前最新的基因组版本是2020年6月更新的，基因注释为Ensembl 98版本，主要包括人和小鼠。

系统要求

Linux系统上运行最低要求：

• 8核Intel或AMD处理器（建议使用32核）

• 64GB RAM（建议128GB）

• 1TB可用磁盘空间

• 64位CentOS     / RedHat 6.0或Ubuntu 12.04

集群模式下运行需要额外满足以下要求：

• 每个节点 8核Intel或AMD处理器

• 每个内核 6GB RAM

• 共享文件系统（例如NFS）

• SGE或LSF批处理系统

软件安装

第一步，解压SpaceRanger文件

tar -xzvf spaceranger-1.1.0.tar.gz

第二步，解压参考基因组文件

tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

第三步，加入环境变量

export PATH=/opt/spaceranger-1.1.0:$PATH

输入文件准备

fastq序列文件：

10x建议测序read2设置90个碱基的长度。从下面10x测试的6个样本来看，reads序列长度达到70bp以后，mapping率就不太变化了，有些样本在长度大于90bp以后mapping率反而下降了。10x给出这样的建议是考虑到建库后插入片段太短的话，太长的序列里面会包含部分polyA甚至UMI序列反而影响比对效果。因为国内目前基本上是测2x150bp的，如果建库片段过短比对率较低的话建议将read2剪切成90bp来分析效果应该会好一点。

Fastq文件名建议是如下格式的，以免运行报错。

图像文件：

Space Ranger支持两种样式的显微镜图像：用苏木精和曙红（H＆E）染色的明场图像，必须是24位彩色TIFF，16位灰度TIFF或JPEG。Space Ranger要求任一方向上的图像至少为2000像素。

注意：图像边框的四个角位置是固定的，比如说三角形在左下角，如果扫描出来的图片四个角的位置变了需要先手动调整过来再使用。

软件运行

一般我们拿到的都是直接是fastq序列文件了，所以可以直接跑spaceranger count，不需要再去运行spaceranger mkfastq了。

spaceranger count运行时图片对其有两种方式，一种软件自动识别图片进行对齐，另外一种就是先用Loupe软件手动对齐，生成对于json文件提供给后面的软件，后期会介绍怎么来手动调整图片。

自动对齐

$ cd /home/jdoe/runs
$ spaceranger count --id=sample345 \
                   --transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
                   --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
                   --sample=mysample \
                   --image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \
                   --slide=V19J01-123 \
                   --area=A1

手动对齐

$ cd /home/jdoe/runs
$ spaceranger count --id=sample345 \
                   --transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
                   --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
                   --sample=mysample \
                   --image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \
                   --slide=V19J01-123 \
                   --area=A1 \
                   --loupe-alignment=sample345.json

参数说明：

--Id：结果输出文件夹名称

--Transcriptome：基因组目录

--Fastqs：fastq文件木兰路

--Sample：原始样本名

--Image：镜像图片文件

--Slide：使用的10x芯片型号

--area：样本所在芯片的区域（四通道芯片位置从上到下分别为A1、B1、C1、D1）

--loupe-alignmen:图片手动对齐生成的json文件，如果是自动对齐不要需要此参数

另外，spaceranger默认使用系统上可用的所有内核来执行管。可以使用--localcores选项来限制使用内核的数量。同理，可以使用-localmem来限制使用内存的大小。

结果输出：

成功运行后会到的下面的信息（包括主要的输出文件）

2016-11-10 16:10:09 [runtime] (join_complete)   ID.sample345.SPATIAL_RNA_COUNTER_CS.SPATIAL_RNA_COUNTER_CS.SUMMARIZE_REPORTS
 
Outputs:
- Run summary HTML:                         /opt/sample345/outs/web_summary.html
- Outputs of spatial pipeline:              /opt/sample345/outs/spatial
- Run summary CSV:                          /opt/sample345/outs/metrics_summary.csv
- BAM:                                      /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index:                                /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered feature-barcode matrices MEX:    /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix
- Filtered feature-barcode matrices HDF5:   /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
- Unfiltered feature-barcode matrices MEX:  /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix
- Unfiltered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix.h5
- Secondary analysis output CSV:            /opt/sample345/outs/analysis
- Per-molecule read information:            /opt/sample345/outs/molecule_info.h5
- Loupe Browser file:                       /opt/sample345/outs/cloupe.cloupe
 
Pipestance completed successfully!

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