PNAS︱何淑君课题组揭示胶质细胞提供时间信号调控神经元发育的新机制

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撰文︱杨梦莹，王红蕾

责编︱王思珍

中枢神经系统由神经干细胞分化出的神经元和胶质细胞组成。过往固有的认知认为神经元是神经系统的主导细胞，胶质细胞起辅助支持的作用。然而，近年来，越来越多的研究表明，胶质细胞作为构成神经系统的重要组成部分，主动调节神经系统的发育及功能，包括神经元轴突延伸，突触形成以及神经信号传递【1】。此外，胶质细胞的过度分裂会导致神经胶质瘤疾病的发生，对人类健康造成危害【2】。这些研究结果表明了胶质细胞在神经系统中具有不可或缺的作用；但是，胶质细胞其他许多新的功能仍未被发掘，等待检视。

神经元的发育过程受到精细且严密的调控。黑腹果蝇蘑菇体（Mushroom Body，MB）是调控学习记忆的中枢，功能等同于人脑海马区。不同类型的蘑菇体神经元受到时空因素的调控，展现出对生物功能至关重要的多样性，调节嗅觉与学习记忆、睡眠、运动等多种行为能力【3】；已知部分机制依赖于神经元内自主性的调控作用，而对于非细胞自主性调控蘑菇体神经元发育的通路及介导的分子，仍知之甚少。

2021年6月8日，上海科技大学生命科学与技术学院何淑君课题组在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为“Glia-derived temporal signals orchestrate neurogenesis in the Drosophila mushroom body ”的研究论文，提出维持胶质细胞中的蛋白稳态是调控神经元正常发育的重要机制。杨梦莹和王红蕾为论文共同第一作者。在此项研究中，作者发现胶质细胞泛素化连接酶dSmurf调节Hedgehog（Hh）信号通路受体Patched（Ptc）与细胞黏附因子Fasciclin II（FasII）的蛋白稳定性，进而调控大脑学习记忆中枢蘑菇体的发育过程。研究团队前期工作表明泛素化修饰是影响胶质细胞分化与增殖的主要通路，一旦功能缺失将导致神经系统发育异常【4】。在这些前期基础上，本项研究深入探索胶质细胞泛素化通路及蛋白质稳态对神经元发育的调控机制，阐明了胶质细胞-神经元的信息传递，促进了对神经发育疾病致病机理的认识。

作者首先观察到，果蝇全身性缺失dSmurf以及选择性抑制胶质细胞dSmurf表达的蘑菇体神经轴突出现异常，在3种不同类型蘑菇体神经元（α/β、α’/β’、g）中只有α/β神经元受到了影响：胶质细胞dSmurf表达水平改变时，α/β神经元轴突束的粗细随之改变，神经元数目减少，而其他两种神经元类型的数目跟形态皆维持正常。这样的现象能够被重新表达dSmurf所修复（图1A-E）。

实验结果表明，胶质细胞dSmurf对α/β神经元的调控开始于果蝇蘑菇体神经干细胞（MB NBs）的分裂增殖：4颗MB NB在发育前期正常分裂和增殖，直到蛹期α/β神经元开始分裂时，胶质细胞dSmurf的生理水平产生变化，调控此阶段（即蛹期）MB NBs的分裂和增殖，从而调控α/β神经元的数量及其轴突形态（图1F-I）。

 图1 胶质细胞dSmurf调控MB神经母细胞的增殖和α/β细胞数量。

（图片来源：何淑君实验室）

已知dSmurf通过多条信号通路调控不同器官的发育，这些通路包括Hedgehog（Hh），BMP，以及Hippo【5-9】。但dSmurf对神经发育的调控机制仍一片空白。经过一连串的探索，作者鉴定出了胶质细胞dSmurf调控的下游通路，发现胶质细胞dSmurf通过调节Hh信号通路跨膜受体Ptc的蛋白稳定性，激活胶质细胞Hh信号。通过监测Hh信号的报告基因Ptc-LacZ的表达，并用果蝇UAS/GAL4表达系统标记胶质细胞（repo-GAL4>UAS-IVS-Syn21-GFP-p10），用β-半乳糖苷酶（β- galactosidase，β-gal）抗体对大脑进行免疫染色，继而侦测LacZ水平，并确定GFP和β-gal共阳性细胞，从而量化胶质细胞Hh信号（图2A, D）。在胶质细胞中表达Hh受体Smoothened（smo）（被Ptc抑制）、ptc-RNAi、或dSmurf时，发现胶质细胞中β-gal强度升高，提示Hh信号水平上升，同时MB α/β神经元胞体区域显示的pH3阳性细胞数明显减少（pH3标记MB NBs的分裂增殖能力），MB NBs分裂增殖能力被削弱（图2C）。这些结果说明胶质细胞dSmurf激活胶质细胞Hh信号，从而抑制MB NBs分裂增殖。

根据已有研究表明，Hh信号可以通过非细胞自主性传播向相邻细胞传导信号【10】。于是，作者进而提出一个猜想：胶质细胞dSmurf激活胶质细胞的Hh信号，并通过非细胞自主性的传播激活神经元Hh信号，从而抑制MB NBs的分裂增殖。为了验证这一猜想，作者在调控胶质细胞dSmurf表达的同时用报告基因Ptc-LacZ来监测α/β神经元细胞中的Hh信号（图2B, E, F）；实验结果表明，在胶质细胞中表达dSmurf、smo或ptc-RNAi皆导致α/β神经元细胞中β-gal强度显著增加，即α/β细胞Hh信号被激活；同时，这些结果也表明，神经元的Hh信号在胶质细胞Hh信号被激活的条件下也会上调。因此，胶质细胞dSmurf是经由激活胶质细胞至神经元的Hh信号传递来调控MB NBs的分裂增殖。

图2 胶质细胞dSmurf激活胶质细胞和神经元Hh信号。

（图片来源：何淑君实验室）

除了鉴定出胶质细胞dSmurf通过Hh调控蘑菇体神经元发育的机制，作者同时揭示了另一条独立于Hh的信号通路，即通过调控细胞粘附分子FasII的蛋白稳定性，从而影响蘑菇体神经元轴突形态。

作者的前期研究发现，抑制胶质细胞dSmurf表达导致细胞粘附分子FasII的表达量升高，提示FasII可能作用于dSmurf的下游。基于此，作者首先证明了在胶质细胞中表达的FasII亚型FasIIB与dSmurf存在结合作用，可能形成同一个复合体（图3A）。细胞实验结果揭示，dSmurf稳定FasIIB，使其半衰期增长，而缺失WW结构域的dSmurf则无法与FasIIB结合，并加快FasIIB的降解（图3B-E），已知WW结构域可通过脯氨酸富含序列识别底物 。这些结果提示：FasIIB可能作用于dSmurf下游通路，从而调控蘑菇体神经元发育。

进一步地，鉴于这些发现，作者建立了同时在果蝇神经元与胶质细胞中操控基因表达的双系统，以检测胶质细胞FasIIB介导的细胞粘附对蘑菇体神经元轴突形态的影响。作者发现，单独表达胶质细胞FasIIB或神经元FasII亚型FasIIA-PEST都会诱导严重的MB α叶缺损（所分析的大脑中分别有30%和72%显示出异常的叶），而两种FasII亚型的共表达则会修复各自的α/β叶缺陷，并且超过73%的叶形态正常；作为对照，在α/β神经元细胞中表达FasII-RNAi时仅有17%的果蝇大脑表现出正常的α轴突叶（图3F, G）。这些结果表明：FasII介导胶质细胞和MB α/β神经元之间的粘附，从而调控α/β轴突形态。另外，作者也发现，dSmurf能够稳定FasIIB在胶质细胞膜上的表达及分布，并调控FasIIB与MB α/β神经元轴突上FasIIA的结合，进而导致MB轴突束间的嗜同性FasIIA亲和力减弱与轴突束化的失调。

 图3 胶质细胞和MB轴突间的嗜同性FasII分子相互作用，调节轴突完整性。

（图片来源：何淑君实验室）

文章最后，考虑到果蝇MB是调控学习记忆及多种行为的中枢，作者检测了缺失胶质细胞dSmurf的果蝇在运动、学习和记忆和抗癫痫麻痹中的重要作用，如图4所示，选择性调控胶质细胞dSmurf表达导致果蝇运动能力以及学习记忆障碍，并产生抗癫痫的麻痹行为（图4A-C）。记忆实验中果蝇对气味的选择正常，说明嗅觉没有受到影响，但学习记忆出现障碍（图4D,E）。

图4 胶质细胞dSmurf表达失调导致果蝇MB相关的行为缺陷。

（图片来源：何淑君实验室）

图5 文章总结图：胶质细胞提供时间信号调节蘑菇体神经元发育。

（图片来源：何淑君实验室）

文章结论与讨论

综上所示，在果蝇发育的蛹形成早期，胶质细胞dSmurf的表达失调会造成胶质细胞中Ptc蛋白内化及转换效率的增加，使得对另一个Hh受体Smo的抑制作用减弱，从而激活胶质细胞的Hh信号。通过非细胞自主性的传递，神经元Hh信号被激活，抑制MB神经母细胞增殖，导致α/β神经细胞数量减少和叶形成异常。此外，胶质细胞dSmurf稳定了FasIIB在细胞膜上的表达，通过其与α/β神经元FasIIA的自体粘附作用调节神经元的轴突形态。本项研究鉴定了胶质细胞泛素化连接酶dSmurf调控MB神经元发育的机制（图5）。

而且，由于MB是果蝇神经系统中的信息整合中心，同时调控多种行为，其发育异常会引起严重的运动及学习记忆能力障碍。因此，揭示胶质细胞蛋白稳态对其神经发育及介导行为的调控机制，具有重要的研究意义。

杨梦莹（后排右二）和王红蕾（前排右二）为论文共同第一作者，何淑君教授（前排左二）为通讯作者

（图片来源：何淑君实验室）

原文连接：https://doi.org/10.1073/pnas.2020098118 

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参考文献（上下滑动查看）  

【1】Allen, N. J. & Lyons, D. A. Glia as architects of central nervous system formation and function. Science 362, 181-185, doi:10.1126/science.aat0473 (2018).

【2】Molinaro, A. M., Taylor, J. W., Wiencke, J. K. & Wrensch, M. R. Genetic and molecular epidemiology of adult diffuse glioma. Nat Rev Neurol 15, 405-417, doi:10.1038/s41582-019-0220-2 (2019).

【3】Lee, T., Lee, A. & Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development 126, 4065-4076 (1999).

【4】Ho, M. S. et al. Gcm protein degradation suppresses proliferation of glial progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 6778-6783, doi:10.1073/pnas.0808899106 (2009).

【5】Cao, L. et al. Ubiquitin E3 ligase dSmurf is essential for Wts protein turnover and Hippo signaling. Biochem Biophys Res Commun 454, 167-171, doi:10.1016/j.bbrc.2014.10.058 S0006-291X(14)01856-7 [pii] (2014).

【6】Chen, C., Yin, S., Cao, W. & Ho, M. S. Drosophila ubiquitin E3 ligase dSmurf is required for synapse remodeling and axon pruning by glia. J Genet Genomics, doi:S1673-8527(16)30172-2 [pii] 10.1016/j.jgg.2016.10.007 (2016).

【7】Liang, Y. Y. et al. dSmurf selectively degrades decapentaplegic-activated MAD, and its overexpression disrupts imaginal disc development. J Biol Chem 278, 26307-26310, doi:10.1074/jbc.C300028200 C300028200 [pii] (2003).

【8】Podos, S. D., Hanson, K. K., Wang, Y. C. & Ferguson, E. L. The DSmurf ubiquitin-protein ligase restricts BMP signaling spatially and temporally during Drosophila embryogenesis. Dev Cell 1, 567-578, doi:S1534-5807(01)00057-0 [pii] (2001).

【9】Xia, L. et al. The Fused/Smurf complex controls the fate of Drosophila germline stem cells by generating a gradient BMP response. Cell 143, 978-990, doi:10.1016/j.cell.2010.11.022S0092-8674(10)01302-4 [pii] (2010).

【10】Yue, S. et al. Requirement of Smurf-mediated endocytosis of Patched1 in sonic hedgehog signal reception. Elife 3, doi:10.7554/eLife.02555 (2014).

制版︱王思珍

本文完