Cereb Cortex︱MET酪氨酸激酶信号转导时序异常是影响小鼠正常皮层神经回路发育和行为的关键机制

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撰文︱马晓况

责编︱王思珍

在大脑皮层神经回路的发育过程中，正常神经元突触连接的形成至关重要，包括调节神经元生长、平衡兴奋性和抑制性突触的形成和消减，以及在适当的时机控制成熟和可塑性【1】。受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase）介导的分子信号显著地影响了这些发生过程【2】。这些过程的紊乱是许多神经发育和神经精神障碍类疾病的标志性病理特征，包括自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）【3】。

人类MET基因编码一种受体酪氨酸激酶，最初在一项基于家族的遗传学研究中被确定为高置信度的ASD风险基因。MET近端启动子中的rs1858830 ‘C’等位基因使基因转录水平减少50%【4】。在ASD患者的皮层样本中，MET基因的表达减少了大约50%，在Rett综合征的患者中几乎不存在【5】。值得注意的是，MET虽然不是ASD的致病基因，但人类功能神经成像研究表明‘C’等位基因与皮层功能连接性改变高度相关【6】。大量的神经发育研究表明，MET蛋白通过参与多条细胞内分子通路共同调节兴奋性锥体神经元树突分枝、树突棘形态、兴奋性突触成熟和皮层可塑性，以及介导发育中的皮层和海马的信号传导【7, 8】。MET的表达仅在早期皮层发育比较高，在小鼠出生后三周迅速下调。然而，人们对MET发育信号发生和结束的调节的功能意义的理解仍然不足。

2021年9月1日，美国亚利桑那大学医学院（The University of Arizona College of Medicine-Phoenix）的Shenfeng Qiu教授团队在Cerebral Cortex在线发表了题为“Disrupted Timing of MET Signaling Derails the Developmental Maturation of Cortical Circuits and Leads to Altered Behavior in Mice”的研究论文。马晓况博士为该论文第一作者。该研究团队利用可控的Met基因过表达转基因小鼠，通过延长MET信号的持续时间使MET过表达，发现了延长MET传导的时程能影响小鼠大脑皮层神经回路的发育成熟并导致小鼠行为改变，揭示了MET信号是控制小鼠皮层神经回路发育和正常行为的关键性机制。

此前的研究已经表明，MET信号在大脑皮层回路的发育过程中受到严格的时间调节。虽然MET信号在时间调节上存在区域和细胞类型的特异性，但总的来说，MET蛋白在前额叶皮质（PFC）、海马（HPC）和初级视觉皮质（VC）等多个皮层区域的表达在最初的2-3周内最强。不变的是，与出生后第一周的表达水平相比，MET蛋白和信号在所有皮质区域的出生后第21天（P21）急剧下调【9】。因此，研究人员假设，适时终止MET信号传导是一个关键性的分子转变，这对小鼠随后的皮层神经回路发育和典型行为是必要的。

在这项研究中，为了确定MET信号下调的功能意义，作者使用了可控的Met过表达转基因小鼠系（controllable transgenic overexpression Met，简称cto-MET），cto-MET小鼠允许对MET表达进行精确的时间控制，通过给小鼠喂养含有强力霉素（doxycycline，DOX）的饲料来抑制转基因小鼠cto-MET中MET信号的传导。相反，去除含DOX的饲料后，MET转基因信号又可以重新传导（图1A-B）。在小鼠出生时开始用含有DOX的饲料喂养母鼠/幼鼠，P14天去除含有DOX的饲料，蛋白免疫印迹结果显示，在P25-28天cto-MET小鼠PFC和HPC的MET表达量明显高于对照组（图1C）。这些数据表明：cto-MET小鼠模型可以使总MET蛋白显着增加，而且cto-MET信号可以由DOX在时间上精确控制。

图1. 使用cto-MET小鼠模型在发育中的皮层内延长MET信号传导

（图片引自：Ma X, et al., Cerebral Cortex, 2021, bhab323）

作者在之前的研究中发现，在发育中的视觉皮层中，cto-MET增强了small GTPase Cdc42和Rac1的活性。Small GTPases，又称小G-蛋白，是一类能结合和水解三磷酸鸟苷（GTP）的水解酶。那么这是否是一种存在于不同皮层区域的通用机制？作者通过蛋白免疫印迹发现，MET蛋白高表达也能显著增强发育过程中前额叶PFC中的Cdc42和Rac1的活性以及P-Ser3（即丝切蛋白（cofilin）的磷酸化）的表达量（图 2A），作者又进一步在PFC中检测了cto-MET 如何影响与突触发生和突触功能相关的突触蛋白的水平。这些数据表明， MET 信号激活了发育中的 PFC 中small GTPase介导的信号通路，该信号通路被证实广泛影响肌动蛋白动力学。作者假设 MET 控制树突棘形态发生和突触分子构成（图 2C）。总之，这些结果表明，在PFC中MET信号参与了与树突棘形态发生和突触发育成熟相关的机制。

图2 . Cto-MET导致PFC中的small GTPase激活和突触蛋白改变

（图片引自：Ma X, et al., Cerebral Cortex, 2021, bhab323）

基于上述研究结果，作者猜想，前额叶投射神经元形态的正常发育是否需要及时下调 MET蛋白表达。作者通过向PFC的第五层（L5）投射至纹状体（CSt）的神经元注射生物素以获得L5神经元的细胞形态，然后利用Neurolucida系统三维重建L5神经元形态（图 3B）以及使用Imaris系统重建L5神经元树突棘的形态（图 3A）。结果显示， cto-MET神经元中树突长度分布和树突分支数显着增加，此外，cto-MET 神经元中树突脊的密度和长度分布显著升高，未成熟的树突脊数量显著增加，成熟的树突脊数量明显下降（图 3C）。这些结果说明，MET蛋白的过度表达显著影响PFC L5神经元的树突分支状况和树突棘的成熟状态。 

值得注意的是，cto-MET诱导的树突脊密度增加和影响肌动蛋白结合蛋白cofilin的抑制性磷酸化表明，延长MET信号可能导致树突棘动力学修剪的破坏。因此，研究人员利用双光子在体成像技术（图 3D），以确定树突棘密度的增加是否可能是树突棘生成增加或树突棘修剪减少的结果。作者将cto-MET小鼠与Thy1-GFP小鼠杂交得到cto-MET:Thy1-GFP三重转基因小鼠，通过磨薄颅骨的方法在初级视觉皮层重复两次双光子成像（间隔7天），对比这一周期内树突棘的形成和消减情况。结果显示，cto-MET的树突棘形成率显著增加、消除率明显降低（图 3E）。这些在体成像数据揭示了MET信号可以影响树突棘的修剪和动力学。

图3 . 持续的MET表达会增加PFC中CSt神经元树突分支和树突棘密度

（图片引自：Ma X, et al., Cerebral Cortex, 2021）

接下来，研究人员通过激光扫描光刺激（laser-scanning photostimulation，LSPS）并结合谷氨酸去笼化（glutamate uncaging）技术探究了MET过表达是否会改变PFC L5神经元层间、局部的突触连接。PFC L5神经元接受来自L2/3层的神经元的主要突触输入，以及其他层的层和其他类型神经元的微弱的突触输入【10】。作者利用LSPS来量化对PFC L5神经元的突触输入【11】。有意思的是，发现，MET过表达显著影响L2/3层兴奋性的突触输入，并没有影响L2/3层抑制性的突触输入（图 4）。这些结果提示：MET信号的持续增强会导致PFC L5神经元局部突触链接的改变，这可能会破坏这些投射神经元不同的输入源和输出源的整合。

图4. Cto-MET导致 PFC局部神经回路连接的改变 

（图片引自：Ma X, et al., Cerebral Cortex, 2021, bhab323）

综上，这些数据表明在内源性MET信号下调后，通过cto-MET维持MET蛋白持续表达两周时间会导致PFC L5神经元的生化特征、细胞形态和电生理特性发生改变。这些变化可以解释突触活动和皮层神经环路的改变。MET信号在皮层神经元中受时间控制的特性可以调控皮层神经回路的可塑性和功能，最终可能会影响动物行为。因此，研究人员使MET在断乳后P21-35持续表达，然后在第16-20周分别测试了矿场（open field）、十字高架迷宫（elevated plus maze）和三室社交互动（three-chamber social interaction）（图 5）。结果表明，在青春期持续表达MET会导致成年小鼠包括重复刻板行为以及社会行为在内的行为的改变。

图5. 在发育过程中cto-MET可以导致成年小鼠的行为学改变

（图片引自：Ma X, et al., Cerebral Cortex, 2021, bhab323）

文章结论与讨论，启发与展望

这项研究使用一种新的具有可调控能力的转基因小鼠，结合跨学科的方法，来确定大脑皮层中兴奋性突触连接和功能成熟的信号机制。这项研究通过实验证明了MET信号的正常时间性调控是小鼠PFC神经回路成熟的关键因子。数据表明在正常的内源性MET信号下调后通过cto-MET转基因小鼠人为的持续表达MET两周时间，可以改变皮层神经元树突结构、树突棘的形态、突触的成熟、皮层神经回路的成熟以及涉及PFC环路的行为学和社会行为的改变。

这项研究证明了cto-MET虽然不会影响小鼠基础运动和焦虑行为，但是增加了大量重复/刻板行为。最值得注意的是，这些小鼠表现出社交能力受损和社交新奇感减低（图 5），目前的工作支持了一种新兴的观点，即神经发育障碍类疾病，如ASD，可能在一定程度上是由于神经回路发育的关键和敏感时期不合时宜的信号传导导致的【12】。MET对发育中的大脑的影响可能是多方面的、长期的、深远的。越来越多的证据表明，发育过程中分子信号事件的关键时机可能对大脑功能产生长远影响。这项研究中描述的细胞、神经回路和行为表型说明了分子调节机制如何导致特定的网络水平（PFC）功能障碍，即便这些不是特定神经发育障碍类疾病的主要病因，但仍然对研究这类疾病有强大的影响。

原文链接：https://academic.oup.com/cercor/advance-article-abstract/doi/10.1093/cercor/bhab323/6362003?redirectedFrom=fulltext

实验室成员（从右至左）：Shenfeng Qiu（通讯作者）、Pat Levitt、Jing Wei、马晓况（第一作者）、陈科

（图片来源：Qiu Lab）

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参考文献（上下滑动查看）  

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【4】Campbell, D.B., et al., A genetic variant that disrupts MET transcription is associated with autism. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006. 103(45): p. 16834-16839.

【5】Aldinger, K.A., et al., Patterns of risk for multiple co‐occurring medical conditions replicate across distinct cohorts of children with autism spectrum disorder. Autism Research, 2015. 8(6): p. 771-781.

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【8】Qiu, S., Z. Lu, and P. Levitt, MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. Journal of Neuroscience, 2014. 34(49): p. 16166-16179.

【9】Chen, K., et al., Time-delimited signaling of MET receptor tyrosine kinase regulates cortical circuit 【10】Markram, H., et al., Reconstruction and simulation of neocortical microcircuitry. Cell, 2015. 163(2): p. 456-492.

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制版︱王思珍

本文完