Autophagy︱叶一泓课题组揭示引起神经元蜡样脂褐质沉积新分子机理：DNAJC5/CSPα基因突变导致溶酶体稳态失衡
撰文︱叶一泓
责编︱王思珍
制版︱查佳雪
神经元蜡样脂褐质沉着症（NCL）是一族遗传性神经退行性溶酶体贮积病。这些疾病是由于脂肪色素（脂褐质）过度沉积而造成的[1]。脂褐质的一个关键特征是它的自发荧光，因而可以通过荧光显微镜进行检测[2]。这些疾病可能发生在婴儿、青少年或成人身上。许多 NCL 致病基因编码溶酶体功能所必需的蛋白，例如溶酶体蛋白酶（例如CTSD） 或控制溶酶体驻留蛋白的运输转运（例如CLN6和CLN8）。由此可见，NCL中的脂褐质积累和神经变性可能是由于溶酶体稳态被破坏所致。
成人型神经元蜡样脂褐质沉着症（ANCL）大部分是由 DNAJC5/CSPα 基因的显性突变引起的。该基因编码一种与囊泡相关的共伴侣蛋白。 DNAJC5具有三个保守结构域：N末端附近的J结构域负责与HSPA8/HSC70伴侣蛋白结合，中央半胱氨酸串（CS）结构域通过棕榈酰化来调控膜结合和运输，而夹在J 和CS结构域之间的接头（LN）结构域的功能尚且不知[3]。与ANCL相关的突变发生在中央半胱氨酸串结构域，包括亮氨酸115变为精氨酸或是亮氨酸116的缺失。在神经元中，DNAJC5 主要与突触小泡相关，但一小部分DNAJC5定位于溶酶体。在非神经元细胞中，DNAJC5 主要与溶酶体相关，但与溶酶体相关的DNAJC5的功能尚不清楚[3]。研究表明，作为HSPA8的共伴侣，DNAJC5 可以控制突触蛋白的折叠和运输，调节钙稳态、膜融合、神经递质释放和突触稳定性。此外，DNAJC5 可以通过被称为错误折叠相关蛋白分泌通路（MAPS）非常规地分泌错误折叠的胞质蛋白[4-6]。但是目前为止，仍然不清楚与ANCL 相关的突变是如何改变DNAJC5的这些功能从而导致神经元蜡样脂褐质沉着。
2022年5月4日，美国国家卫生研究院的叶一泓（Yihong Ye）团队在Autophagy上发表了题为“Abnormal triaging of misfolded proteins by adult neuronal ceroid lipofuscinosis-associated DNAJC5/CSPα mutants causes lipofuscin accumulation”的论文，阐述了DNAJC5/CSPα的两种不同但却密切关联的蛋白质量控制功能：微自噬以及MAPS，并揭示了与ANCL 相关的DNAJC5/CSPα突变是如何影响这些功能从而引发神经元蜡样脂褐质沉积和神经元凋亡。Juhyung Lee博士为第一作者，叶一泓（Yihong Ye）研究员为通讯作者。
基于DNAJC5在溶酶体上的定位，作者假定DNAJC5 可能会伴随蛋白底物进入溶酶体的内腔。为了验证这个想法，作者建立了一个基于Keima荧光蛋白的检测方法。Keima是一种单体双激发荧光蛋白（λemmax ~620 nm），在中性pH值（6.0-8.0）下的440 nm或酸性环境（pH<6.0）下的550 nm 处具有最大激发信号（图1A）[7]。当与蛋白融合后，Keima允许通过荧光显微镜或流式细胞术定量测量该蛋白运输到酸性内溶酶体的过程[8]。共聚焦显微镜显示稳定表达 Keima 的HEK293T细胞仅存在中性细胞质荧光。相比之下，在表达Keima-DNAJC5的细胞中，作者在细胞质膜上检测到中性Keima-DNAJC5信号，但在细胞内囊泡上的Keima-DNAJC5却同时发出中性和酸性的荧光信号（图1B）。因此，这些溶酶体的表面和管腔中都含有 Keima-DNAJC5。流式细胞术显示，与Keima相比，Keima-DNAJC5有更高的酸性与中性荧光比值（图1C）。正如预期的那样，溶酶体酸化阻断剂巴弗洛霉素A1（Baf. A1）可以显注降低了酸性Keima-DNAJC5的信号，同时增加了中性Keima-DNAJC5信号（图1D）。进一步实验表明DNAJC5的溶酶体易位不需要 J 结构区。有趣的是，删除 J 结构域进一步增强了DNAJC5的溶酶体易位（图1E）。DNAJC5的溶酶体易位不仅发生在非神经细胞中，在神经元中 也可以检测到（图1F）。以上实验表明DNAJC5 可以进入内溶酶体的内腔。
图1 DNAJC5易位至溶酶体内腔
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
为了证明DNAJC5可以陪伴错误折叠的蛋白质进入溶酶体，作者使用带有mCherry标记的截短绿色荧光蛋白（GFP1-10）作为模型底物。使用一种基于光漂白的成像分析[5]，作者可以检测到活细胞中与溶酶体相结合的一小部分mCh-GFP1-10。DNAJC5 的共表达增加了mCh-GFP1-10与溶酶体的结合，这在表达DNAJC5 ΔJ的细胞中更加明显（图2A: ii,iii ,i; 图 2B）。在表达野生型（WT）DNAJC5或者DNAJC5 ΔJ的细胞中，含有mCh-GFP1-10的囊泡也同时含有 DNAJC5 ΔJ 和晚期内吞体/溶酶体蛋白 RAB9（图2A: iv-ix）。这些结果表明DNAJC5可以用不依赖J区域的方式将mCh-GFP1-10募集到溶酶体中。
作者使用SNCA/α-突触核蛋白对上述结论做了进一步验证。SNCA/α-突触核蛋白是一种与帕金森病相关的易于错误折叠的蛋白质。稳定表达mCherry标记的人源SNCA的U2OS细胞主要显示细胞质mCh-SNCA信号，但作者检测到一些含有 SNCA 的囊泡（图2C: i）。DNAJC5表达显著刺激SNCA与膜的结合，导致许多明亮的mCh-SNCA斑点信号（图2C: i, ii）。正如所料，囊泡相关的SNCA与DNAJC5 还有溶酶体标记蛋白LAMP1均存在共定位（图2C: iii-vi）。因此，作者认为DNAJC5可以促进错误折叠的蛋白质与溶酶体的结合。
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
作者接下来使用稳定表达Keima-SNCA的细胞进一步证明了DNAJC5可以促进错误折叠的蛋白质易位到溶酶体内腔中（图2D, E）。他们认为这一过程可能是通过微自噬形成的，因为作者用一个显性失活（DN）VPS4 突变体E228Q可以阻断ESCRT介导的微自噬[9]，而这也同时消除了酸性Keima-SNCA的荧光信号（图2D, E）并同时降低了酸性Keima-DNAJC5的荧光信号（图2F）。这些结果表明DNAJC5伴侣蛋白可以通过ESCRT介导的微自噬将错误折叠的蛋白质易位到溶酶体的内腔中。
作者接下来探询了DNAJC5介导的微自噬是否参与了MAPS。通过免疫印迹分析，作者发现MAPS底物GFP1-10的分泌可以被DNAJC5 或者DNAJC5 ΔJ的共表达增强（图2 G）。有趣的是，一部分DNAJC5也被分泌到胞外，而DNAJC5 ΔJ的分泌水平更远高于WT DNAJC5（图2 G）。当作者在VPS4 DN过表达的情况下检查GFP1-10和DNAJC5的分泌时，令人惊讶的是，VPS4 DN在基础和DNAJC5过表达条件下都显着增加了GFP1-10的分泌（图2 H,I）。这些结果表明DNAJC5介导的微自噬和MAPS是两个平行但功能耦联的质量控制过程。
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
为了了解上述DNAJC5功能如何受到ANCL相关突变的影响，作者使用mCh-SNCA表达细胞测试了DNAJC5 L115R和L116Δ突变体是否仍然促进错误折叠的SNCA与溶酶体的结合。与WT DNAJC5一样，mCitrine（mCi）标记的DNAJC5 L115R和DNAJC5 L116Δ均刺激mCh-SNCA与溶酶体的结合（图3A,B）。同样，当分析Keima-SNCA的溶酶体易位时，疾病相关突变体在促进酸性Keima-SNCA荧光信号方面与WT DNAJC5一样活跃（图3C,D）。同时，Keima-DNAJC5 L115R和L116Δ突变体本身也都比WT DNAJC5更有效地易位到内溶酶体中（图3E, F）。这些结果表明 ANCL 突变不抑制DNAJC5的微自噬活性。
作者接下来检查了这些ANCL突变是否改变了DNAJC5促进MAPS的功能。他们发现与WT DNAJC5不同，DNAJC5 L115R和DNAJC5 L116Δ都不能促进GFP1-10的分泌（图3G,H）。此外，与 WT DNAJC5 相比，DNAJC5 L115R和L116Δ突变体本身的分泌也减少了（图 3G,I）。因为这些ANCL突变显着降低了DNAJC5的棕榈酰化[10]，并且因为删除CS结构域或用棕榈酰转移酶抑制剂处理细胞都可抑制了DNAJC5在MAPS中的功能，因此DNAJC5棕榈酰化似乎对MAPS至关重要，但对于微自噬是不必要的。重要的是，这些数据排除了溶酶体作为MAPS的分泌中间区室的可能性。
图4 DNAJC5通过接头域将其定位到LAMP1 阴性的核周区室从而介导MAPS
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
在排除溶酶体作为MAPS的区室后，作者使用内源性表达DNAJC5羧基末端带有GFP的HEK293T 细胞通过3D共聚焦显微镜对DNAJC5重新进行了亚细胞定位。他们发现一部分DNAJC5存在于核周囊泡中，而这些囊泡不带有LAMP1，也在溶酶体特异性染料LysoTracker处理后呈阴性（图4A ）。DNAJC5的核周定位在过表达WT mCi-DNAJC5的U2OS细胞中变得更加明显（图4B:i-vi）。相比之下，与ANCL相关的突变体在该囊泡上基本不存在。同时，DNAJC5 L115R和L116Δ 都显示出与 LAMP1的共定位增加（图4B:vii-xii）。
为了找出导致DNAJC5定位于核周LAMP1阴性区室的结构域，作者通过共聚焦显微镜分析了一组 DNAJC5缺失突变体（图4C,D）。结果表明，缺乏接头（ΔLN）的Ci-DNAJC5突变体仍然与 LAMP1阳性囊泡相关，但在核周囊泡中基本上不存在（图4B: xvi-xviii; 图4D）。同时，Keima-DNAJC5 ΔLN的溶酶体易位也显著增加（图3F）。ΔLN和ANCL突变体的相似亚细胞定位促使作者通过免疫印迹测试DNAJC5 ΔLN的分泌。结果显示其与DNAJC5 ΔCS有相似的分泌缺陷（图4E,F）。这些数据表明LN和CS域共同作用以赋予DNAJC5核周囊泡定位，并由此介导 MAPS。
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
为了探寻调节DNAJC5在LAMP1阴性区室定位的因子，作者使用稳定表达带有FLAG和SBP（链霉亲和素结合蛋白）标签的DNAJC5 ΔJ的细胞进行串联亲和纯化。质谱分析确定SLC3A2/CD98hc（一个异二聚氨基酸转运蛋白的辅助因子）作为DNAJC5的结合伙伴（图5A）。免疫共沉淀显示内源性 SLC3A2与DNAJC5 ΔJ和WT DNAJC5都能相互作用（图5B）。使用在内源性SLC3A2基因座处带有 GFP标签的细胞系进行相互下拉进一步证实了这一相互作用（图5C）。重要的是，当作者将 DNAJC5变体转染到SLC3A2::GFP细胞中并进行GFP下拉时，与其他变体相比，DNAJC5 ΔLN和DNAJC5 ΔCS显示出与SLC3A2结合的显着降低（图5C）。SLC3A2和DNAJC5之间的相互作用还可以通过共聚焦显微镜下的共定位来进一步验证（图5D,E）。综上，这些结果证明了SLC3A2 和DNAJC5之间的特定相互作用，这需要 DNAJC5 接头（LN）和CS结构域。
接下来作者对SLC3A2 耗尽或对照敲除细胞中的内源 DNAJC5 和 LAMP1 进行了免疫染色。在对照细胞中，很容易看到LAMP1阴性隔室中的DNAJC5。相比之下，在SLC3A2 敲除细胞中，DNAJC5几乎完全不存在于该隔室中（图5F-H），导致其与 LAMP1 的共定位变得更加突出。流式细胞术显示 SLC3A2 缺乏或过表达不会显着影响 Keima-DNAJC5 的溶酶体易位。因此，SLC3A2和 DNAJC5 LN 区域的相互作用是 DNAJC5 核周结合所特别需要的，但对于它的溶酶体易位是非必要的。
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
作者使用SNCA和GFP1-10作为模型底物进一步测试了DNAJC5介导的MAPS是否需要SLC3A2，事实上，当SLC3A2在 HEK293T细胞中被敲低60-80 % 时，这些蛋白质在基础条件下或在DNAJC5 过表达细胞中的分泌都显著减少（图6A-D）。此外，在SLC3A2缺陷细胞中，DNAJC5本身的分泌也受到抑制（图6A, B, E）。SLC3A2 敲低也减少了原代神经元在 SYN1 启动子下表达的 SNCA 的分泌。这些结果证明了 SLC3A2 在 DNAJC5 介导的 MAPS 中的作用。
鉴于DNAJC5 与脂褐质沉积之间的联系，作者研究了SLC3A2缺乏是否会导致类脂褐质自发荧光储存材料（AFSM）的积累。共聚焦显微镜分析表明，约19 %的SLC3A2 缺失HEK293T细胞都含有一个或两个可通过紫外光激发检测到的球形斑点（图6F）。相比之下，这种结构仅在不到0.5 %的WT细胞中检测到。3D共聚焦分析结合双色荧光显微镜显示，SLC3A2敲除细胞中的 AFSM被富含 DNAJC5和RAB9 的膜包围，表明他们可能来自溶酶体（图6G）。在 SLC3A2 敲除细胞中观察到的所有的AFSM中，免疫染色都可以检测到Saposin A1（一种已知的脂褐质标记物 [11]）（图6H）。此外，来自携带CLN2 突变的晚期NCL患者的细胞也含有类似自发荧光结构（图6I），并且在形态上与SLC3A2 敲除细胞中的如出一辙[12]。这些都证实了它们的脂褐质的身份。有趣的是，过表达DNAJC5 ΔLN、L115R或L116Δ的细胞也Saposin A1阳性的AFSM的累积（图6J），尽管与SLC3A2 敲除细胞相比它们的体积更小。由于CLN2编码溶酶体肽酶，我们的研究结果表明，脂褐质生物发生与溶酶体降解缺陷或蛋白质和膜过度流入溶酶体有关。
图7 DNAJC5和SLC3A2在国蝇ANCL模型中的遗传相互作用
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
最后作者使用新近建立的果蝇模型来进一步评估DNAJC5和SLC3A2在神经退行性疾病中的作用。他们使用GMR-Gal4驱动因子在果蝇幼虫眼睛的感光细胞中表达人类DNAJC5 (HsDNAJC5) 或ANCL 相关的DNAJC5 L116Δ突变体。正如之前报道的[13]，DNAJC5 L116Δ 过表达导致大量神经元细胞死亡，导致在25 ℃下饲养的成年果蝇出现严重的粗眼表型（图7A'）。有趣的是，幼虫眼盘的共聚焦显微镜分析显示，表达DNAJC5 L116Δ 的组织在感光细胞的顶端细胞质中含有许多自发荧光点（图7B-D）。相比之下，表达WT DNAJC5没有改变眼睛的形态， 也没有自发荧光点的累积（图7A）。当作者用SLC3A2靶向shRNA消耗约60%的内源性SLC3A2 mRNA，他们发现即使在表达WT DNAJC5的果蝇中也出现适度的粗糙眼表型，并且有明显的色素损失（图7E）。因此，SLC3A2的消耗增强了由DNAJC5过表达诱导的神经元细胞死亡。作者推测这可能是因为它破坏了DNAJC5介导的MAPS和微自噬之间的平衡，导致错误折叠的蛋白质和膜流向溶酶体的流量失衡所造成的。
图8 文总结图：DNAJC5介导的蛋白质质量管控通路
（图源：Lee J, et al., Autophagy, 2022）
而对于DNAJC5在MAPS中的机理，作者在文中也做了进一步的阐述。他们发现一小部分DNAJC5定位于核周膜隔室。该隔室大部分不含LAMP1，并且不被LysoTracker染料很好地染色。然而，这个隔间在长时间染色后可以被LysoTracker弱标记，这表明它可能是一个前溶酶体隔间。DNAJC5定位到这个隔室不需要它的J结构域，但取决于DNAJC5的棕榈酰化，并需要SLC3A2作为DNAJC5 的结合伙伴。作者的研究表明该DNAJC5的核周区室在MAPS中起重要作用。但是关于错误折叠蛋白质如何进入与DNAJC5相关的核周区室并最终分泌到细胞外的机理仍有待阐明。
DNAJC5介导的微自噬和MAPS并行运作以维持溶酶体稳态平衡。不难想象，这两个耦联的过程可以有效防止有毒物质过度溢入到溶酶体内。如果调整得当，这些过程应该可以有效减少错误折叠的蛋白质并改善细胞稳态。与之相反，这些过程的失调可能导致错误折叠的蛋白质在溶酶体内或细胞外部的过渡积累。缺乏J结构域的DNAJC5在溶酶体易位和蛋白质分泌中的活性显着增加。这表明DNAJC5受到严格的自身抑制调控，但细胞是如何对DNAJC5的活性进行有效调控仍需进一步研究。
总之，该研究首次发现ANCL 相关的DNAJC5突变不能简单归类为功能丧失或功能增强的等位基因。事实上，虽然这些突变消除了DNAJC5 的前溶酶体定位和相应的MAPS功能，但它们增加了DNAJC5易位到溶酶体中的活性。在这种情况下，错误折叠的蛋白质和膜异常流入溶酶体，随着时间的推移破坏这个细胞器从而形成未消化的脂褐质残留物，并导致神经元凋亡。该模型首次提示了通过控制微自噬来治疗神经元蜡样脂褐质沉着症的可能性。
这项研究得到了美国国家卫生研究院下属 糖尿病，消化道与肾疾病研究所院内研究计划的支持。Juhyung Lee博士为第一作者，美国国家卫生研究院的叶一泓（Yihong Ye）研究员为通讯作者。
Juhyung Lee博士 （左）；叶一泓研究员 （右）。
（照片提供自叶一泓实验室）
细胞中的蛋白质错误折叠会造成应激状况，导致细胞凋亡从而引发许多人类疾病。错误折叠的蛋白质可以通过蛋白质聚集导致蛋白质功能丧失而引起毒性，或者当聚集的蛋白质募集和灭活其他重要细胞因子从而间接引发功能缺失。错误折叠的蛋白质聚集与阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病密切相关，这些疾病目前还没有有效的控制方法，更不用说治愈。这凸显了更好地了解细胞如何应对蛋白质错误折叠的重要性。
叶一泓研究团队在研究蛋白质质量控制机理方面取得了许多实质性进展。他们团队的主要贡献包括：1）发现p97、Derlins、VIMP、Bag6-Ubl4-Trc35等蛋白质在内质网相关蛋白降解通路中的作用；2）证明p97可以作为肿瘤治疗的靶点并开发出多个p97抑制剂；3）发现与错误折叠相关的蛋白分泌 （MAPS）通路；4）发现内质网转运阻塞相关的蛋白质量控制通路；5）发现Tau聚集体和α-突触核蛋白聚集体在细胞表面的受体；6）发现硫酸乙酰肝素蛋白聚糖作为共同受体参与SARS-CoV-2细胞感染；7）发现DNAJC5介导的微自噬。他们的长期目标是开发小分子或大分子药物以减少细胞中错误折叠蛋白质的产生以及处理失衡，从而使患有蛋白质错误折叠相关疾病的患者受益。
目前的主要研究的方向包括：
1、错误折叠相关蛋白分泌（MAPS）的机理以及在神经退行性疾病中的作用。
2、错误折叠的α-突触核蛋白和Tau聚集体在细胞间传递以及相关毒性的机理。
3、内溶酶体微自噬在神经退行性疾病中的作用。
4、内质网转运阻塞相关蛋白质量控制机制。
该团队在美国马里兰国家卫生研究院的实验室目前有博士后职位空缺。欢迎对神经退行性疾病有兴趣的新近博士毕业生联系：yihongye@gmail.com。
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本文完