神经云课堂︱Dnmt1：让ta共济失调的基因

来源︱赛业生物订阅号

撰文︱小   赛

编辑︱杨彬伟

Dnmt1基因编码DNA甲基转移酶I，可将甲基转移到基因组DNA的胞嘧啶核苷酸上，该基因的异常与耳聋、小脑共济失调等神经系统疾病有关。

今天和大家见面的是Dnmt1基因编辑小鼠。

一、Dnmt1 基因简介

该基因编码DNA甲基转移酶I，该酶是DNA胞嘧啶甲基化的维持酶，可将甲基转移到基因组DNA的胞嘧啶核苷酸上，在胚胎发生期间和出生后的中枢神经系统（CNS）高表达。该基因的变异与小脑共济失调、耳聋和发作性睡病等神经系统疾病有关。其相关途径包括激活的PKN1刺激AR（雄激素受体）调节基因KLK2和KLK3的转录以及胞嘧啶甲基化。

图1. Dnmt1的基因相关信息（https://rddc.tsinghua-gd.org/）

图2. Dnmt1蛋白结构（https://alphafold.ebi.ac.uk/）

二、Dnmt1 相关疾病介绍

与DNMT1相关的疾病有小脑共济失调、耳聋和发作性睡病等神经系统疾病。

小脑共济失调是因脑组织变形而引起的随意运动失调的病症，小脑共济失调的主要临床症状为四肢共济失调、吞咽困难、眼球突出、肌张力障碍、痉挛等。该症可分为继发性小脑共济失调和遗传性小脑共济失调。继发性小脑共济失调的致病因素有感染、乙醇中毒、维生素缺乏、代谢疾病、心血管疾病及肿瘤等。遗传性小脑共济失调可分为常染色体显性遗传性、常染色体隐性遗传性以及X连锁性小脑共济失调。该病的治疗药物有激素类药物（肾上腺皮质激素）、免疫球蛋白与丁螺环酮等[1,2]。

三、Dnmt1 ‍基因编辑小鼠

CNS前体细胞特异性敲除小鼠：Fan G等人在Dnmt1基因4和5号外显子两侧插入loxp位点，再通过与Nestin-Cre转基因小鼠杂交，以产生敲除4和5号外显子序列的CNS前体细胞特异性敲除小鼠。研究人员对剖腹产的E18.5和E19.5小鼠进行分析发现，与对照小鼠（Dnmt1^2lox/2lox）相比，特异性敲除小鼠（Dnmt1^2lox/2lox；Nestin-Cre）在产后1h内死亡。电生理学结果表明，正常小鼠产后5min舌下神经活动表现出有节奏的类似喘息的模式图（12/min），随着呼吸频率和心率的增加，其舌下神经活动也加快，并在10-20分钟内保持平稳，相比之下Dnmt1^2lox/2lox；Nestin-Cre小鼠仅产生零星的喘息活动，并在分娩后20-30分钟持续心跳异常，不久后死亡。病理组织学结果表明，Dnmt1^2lox/2lox；Nestin-Cre小鼠脑干舌下神经元形态正常（图3）［3]。

PV细胞敲除小鼠：

Hahn A等人将Dnmt1^loxP2与Pvalb-Cre/tdTomato小鼠交配，以产生PV（小白蛋白）细胞敲除小鼠。研究发现，WT（Pvalb-Cre/tdTomato）小鼠运动和视觉皮层区域的tdTomato细胞显著减少，表层和深层皮质层均受到中间神经元减少的影响，小鼠的细胞密度在12月龄时开始呈下降趋势，这表明中间神经元是12月龄开始退化的。与WT相比，16月龄的Dnmt1 KO（Pvalb-Cre/tdTomato/Dnmt1^loxP2）小鼠的运动和视觉皮层区域tdTomato阳性中间神经元密度显著更高。以上结果表明，Dnmt1缺失显著提高了表达PV的皮质中间神经元的长期存活率，Dnmt1功能直接或间接损害老年小鼠皮质PV中间神经元存活率（图4）［4]。

图3. 第1 2颅舌下神经活动。

图注：A：舌下神经呼吸放电的电生理记录。每条迹线图均是用皮下电极获得的心电图记录（第二条迹线图为膈肌电图）。B：脑干舌下神经元组织学切片，E18.5石蜡切片。比例尺：37.5 μm。

图4. Dnmt1 敲除增强了皮质中间神经元的长期存活率。

图注：(A,B)：矢状切片(Bregma 1.44)显微照片显示6、12和16个月大的Pvalb-Cre/tdTomato (WT, A) 和 Pvalb-Cre/tdTomato/Dnmt1^loxP2 ( KO，B)小鼠显示tdTomato（红色）和DAPI阳性细胞（蓝色）。每个区域的细胞密度在 (C) 中进行了量化。（D）：6个月和16个月大的Dnmt1 WT和KO小鼠在运动，体感和视觉皮层中的细胞密度的特异性分析。分析切片的数量如下：6个月大的WT：运动皮层n=16，躯体感觉皮层n=15，视觉皮层n=13；6个月大的KO：运动皮层 n=19，体感和视觉皮层 n=16；12个月大的WT和KO：每个皮层区域n=9个切片；16个月大的WT：运动和视觉皮层n=14，体感皮层n=12；16个月大的 KO每个皮质区域n=9（来自每个基因型和年龄的N=3个不同的大脑）。比例尺：100 μm。

四、总结

小鼠Dnmt1功能丧失所导致的神经系统异常具有潜在的临床意义，对该基因的深入研究有助于探讨神经系统疾病的发病机制，同时亦可用于此类疾病治疗新方法的研究。

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参考文献（上下滑动阅读） 

1. Miranda CO, Nobre RJ, Paiva VH, Duarte JV, Castelhano J, Petrella LI, Sereno J, Santana M, Afonso S, Januário C, Castelo-Branco M, de Almeida LP. Cerebellar morphometric and spectroscopic biomarkers for Machado-Joseph Disease. Acta Neuropathol Commun. 2022 Mar 19;10(1):37. doi: 10.1186/s40478-022-01329-4. PMID: 35305685; PMCID: PMC8933766.

2. Rajan DS, Kour S, Fortuna TR, Cousin MA, Barnett SS, Niu Z, Babovic-Vuksanovic D, Klee EW, Kirmse B, Innes M, Rydning SL, Selmer KK, Vigeland MD, Erichsen AK, Nemeth AH, Millan F, DeVile C, Fawcett K, Legendre A, Sims D, Schnekenberg RP, Burglen L, Mercier S, Bakhtiari S, Martinez-Salas E, Wigby K, Lenberg J, Friedman JR, Kruer MC, Pandey UB. Autosomal Recessive Cerebellar Atrophy and Spastic Ataxia in Patients With Pathogenic Biallelic Variants inGEMIN5. Front Cell Dev Biol. 2022 Feb 28;10:783762. doi: 10.3389/fcell.2022.783762. PMID: 35295849; PMCID: PMC8918504.

3. Fan G, Beard C, Chen RZ, Csankovszki G, Sun Y, Siniaia M, Biniszkiewicz D, Bates B, Lee PP, Kuhn R, Trumpp A, Poon C, Wilson CB, Jaenisch R. DNA hypomethylation perturbs the function and survival of CNS neurons in postnatal animals. J Neurosci. 2001 Feb 1;21(3):788-97. doi: 10.1523/JNEUROSCI.21-03-00788.2001. PMID: 11157065; PMCID: PMC6762314.

4. Hahn A, Pensold D, Bayer C, Tittelmeier J, González-Bermúdez L, Marx-Blümel L, Linde J, Groß J, Salinas-Riester G, Lingner T, von Maltzahn J, Spehr M, Pieler T, Urbach A, Zimmer-Bensch G. DNA Methyltransferase 1 (DNMT1) Function Is Implicated in the Age-Related Loss of Cortical Interneurons. Front Cell Dev Biol. 2020 Jul 22;8:639. doi: 10.3389/fcell.2020.00639. PMID: 32793592; PMCID: PMC7387673.

本文完