iScience︱王绪化/王志萍团队合作发现UBE4B有望成为卒中治疗新靶点：UBE4B下调促进卒中后中枢神经轴突再生和功能恢复

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撰文︱靳   爽
责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

卒中（stroke）是全球第二大死亡原因，约占死亡总人数的11%，目前有8000多万患者正在遭受卒中带来的痛苦[1]。卒中分为缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中是由于脑部血管的血流受阻，脑组织无法获得氧气和营养物质造成的，占卒中病例的60-70%。在缺氧和缺血最严重的缺血核心，包括神经元在内的脑细胞迅速死亡，导致不可逆的神经元损伤[2]。在接受晚期治疗的卒中患者中，缺血核心面积更大，功能丧失更严重。因此，开发脑卒中后增强神经修复和功能恢复的方法至关重要。

2022年12月26日，浙江大学医学院王绪化研究员/王志萍研究员课题组合作在iScience上发表了题为“Downregulation of UBE4B promotes CNS axon regrowth and functional recovery after stroke”的研究。该研究基于视神经损伤模型筛选找到并鉴定了UBE4B作为神经再生的内源性调控因子，发现敲除UBE4B促进神经再生的双通路机制，并揭示了通过过表达泛素变体UbV.E4B（一种UBE4B的竞争性抑制剂）的方法来抑制UBE4B的功能，能够促进皮质脊髓束的芽生，进而导致皮质脊髓束依赖的前肢运动功能的恢复。该研究为中枢神经系统损伤后的治疗提供理论依据，为脑卒中后提高神经元内在再生能力，重塑功能性神经环路提供了新的治疗方案和思路。

中枢神经系统损伤后的修复离不开神经轴突再生，在神经轴突再生的过程中，需要大量促进轴突再生的蛋白质高调和抑制轴突再生蛋白质的降解，这些过程需要蛋白质质量控制系统的调控。蛋白质降解途径主要包括溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。溶酶体降解途径是非选择性的蛋白质降解途径，而泛素化途径具有特异性，受到严格的调控[3]。泛素化在神经元的发育和存活中发挥关键作用，但其在成熟中枢神经系统轴突再生中的作用和调控机制还不清楚。

由于有文献指出，泛素化降解途径可以通过p53通路调控轴突再生[4]，因此作者推测影响p53降解的蛋白质质量控制相关分子可能在调控神经轴突再生中发挥重要作用。为了证明这一推测，作者首先借助Rosa26-LoxP-STOP-LoxP-Cas9 knockin转基因小鼠，利用腺相关病毒（AAV）介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术，实现了小鼠视网膜神经元内五种能够调控p53蛋白降解的蛋白质质量控制基因的敲除。通过比较五种不同的实验处理对成年小鼠视神经损伤后轴突再生的作用，发现敲除泛素链组装因子UBE4B可以最为显著地促进视神经的轴突。然后，作者运用Cre/LoxP系统及纯合UBE4B^loxp/loxp转基因小鼠，探究UBE4B敲除对视神经（图1）和皮质脊髓神经损伤后轴突再生（图2）的影响，发现UBE4B条件性敲除促进视网膜神经节细胞和皮质脊髓神经元轴突损伤后的再生。此外，UBE4B和PTEN的联合敲除，能够促进视神经损伤后更强劲的再生。

图1 UBE4B敲除促进视神经再生

（图源：Jin, et al., iScience, 2022）

图2 UBE4B敲除促进皮质脊髓轴突芽生

（图源：Jin, et al., iScience, 2022）

mTOR通路是调控轴突再生的关键通路[5,6]，作者推测UBE4B的敲除可能通过改变mTOR的活性以及p53的表达量来促进轴突再生。为了验证这一假设，作者对UBE4B、p53和pS6（mTOR活性的一个指标）的表达量进行了检测，观察到UBE4B基因敲除后，p53和pS6的表达显著上调（图3），说明UBE4B可以同时调控p53信号通路和mTOR信号通路。KLHL22是UBE4B的主要底物[7]，KLHL22泛素连接酶复合物在哺乳动物中介导mTORC1的激活并在下游事件中发挥保守作用，KLHL22/mTOR通路被证实能够激活氨基酸依赖的mTORC1信号[8]。为了研究UBE4B敲除诱导的轴突再生是否由其下游底物p53和KLHL22所介导，作者共敲除UBE4B/p53或UBE4B/KLHL22，发现UBE4B敲除诱导的轴突再生减弱（图4）。这些数据表明：UBE4B通过下游p53和KLHL22/mTOR双通路调控轴突再生。

图3 UBE4B敲除上调p53并激活mTOR

（图源：Jin, et al., iScience, 2022）

图4 UBE4B敲除通过双通路调控轴突再生

（图源：Jin, et al., iScience, 2022）

神经再生疗法为脑卒中患者不可逆脑损伤的功能恢复开辟了新的途径[9]，通过皮质脊髓束（Corticospinal tract，CST）的再生来重新支配脊髓是皮质卒中后一种很有前途的促进功能恢复的策略[10]。为了将以上发现推向潜在的临床应用，作者在大鼠皮质卒中模型中，采用AAV基因递送的方法，在皮质脊髓神经元过表达UbV.E4B蛋白，一种UBE4B的竞争性抑制剂[11]，来实现对UBE4B功能的抑制，并进一步在形态学和行为学水平上探究了UBE4B下调对卒中后神经再生和功能恢复的影响（图5），结果显示：UbV.E4B治疗方法可促进皮质脊髓轴突的芽生，进而促进皮质脊髓轴突依赖的前肢运动功能的恢复。

图5 UbV.E4B治疗促进卒中后皮质脊髓轴突芽生及运动功能恢复

（图源：Jin, et al., iScience, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究不仅发现UBE4B在中枢神经系统轴突再生中起着重要作用，而且发现UBE4B敲除通过同时激活p53和KLHL22/mTOR双信号通路调控中枢神经系统损伤后的轴突再生，揭示了中枢神经系统轴突再生调控的新机制。将UBE4B作为靶标物，研究其在促进中枢神经系统轴突再生的药物筛选中的应用，作者进行了深入的研究，不仅发现泛素变体UbV.E4B能够增加神经元的内在再生能力，而且在大鼠皮质卒中模型中，健侧皮层过表达UbV.E4B促进了CST轴突芽生和CST依赖的运动功能的恢复。该研究表明，单独的UbV.E4B过表达足以触发CST轴突芽生和功能恢复，这表明UbV.E4B是一种潜在的脑卒中治疗方法，为转化医学应用该措施来提高卒中患者运动功能的恢复提供了依据。然而，再生的CST轴突可能需要经过进一步的神经调控，以更好地促进芽生轴突形成的新环路的功能化。由于康复训练和电刺激可以促进CST轴突在功能性脊髓网络的可塑性[12-18]，康复训练、电刺激和UbV.E4B的结合可能会进一步改善脑卒中后的功能恢复。因此，联合应用多种措施来促进神经损伤后的功能恢复值得进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105885

第一作者：靳爽（左），通讯作者：王志萍（中），通讯作者：王绪化（右）

（照片提供自：王绪化/王志萍团队）

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通讯作者（上下滑动阅读） 

王绪化，浙江大学基础医学院研究员。实验室主要研究治疗中枢神经系统疾病（包括脑卒中及中枢神经损伤）的药物及药物递送系统。主要研究兴趣包括：基于人工智能技术的药物发现和AAV设计，非病毒递送载体，组织工程与再生医学，脑机接口技术。实验室详情请参考实验室主页（www.zjuwanglab.com）。

该研究得到国家科技创新2030-“脑科学与类脑研究”重大项目、国家自然科学基金、浙江省杰出青年科学基金、中央高校基本科研业务费专项等基金的资助。

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参考文献（上下滑动查看）  

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本文完