Cell︱美国威尔康奈尔医学院甘莉团队基于人类iPSC 4R Tau蛋白病模型揭示Tau蛋白繁殖的修饰因子
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撰文︱罗 聪
责编︱王思珍
Tau蛋白病是一种与年龄相关的神经退行性疾病，其机制基础仍不清楚，部分原因是缺乏适当的人类模型。人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元在建模神经系统疾病方面具有无限潜力。iPSC衍生的神经元结合CRISPR-Cas9技术实现了精确的疾病建模和基于功能基因组学的疾病修饰因子识别。然而，iPSC来源的神经元中4R Tau表达极低，因此不适用于4R Tau蛋白病建模。这也导致了很难在iPSC来源的神经元中再现大量Tau蛋白聚集。
近日，美国威尔康奈尔医学中心甘莉（Li Gan）教授团队在Cell上发表了题为“Human iPSC 4R tauopathy model uncovers modifiers of tau propagation”的研究论文。作者设计并诱导分化出表达4R Tau或携带P301S MAPT突变的4R Tau（4R-P301S）的iPSC来源神经元，在使用Tau纤维进行种子作用后，4R-P301S神经元出现了进行性Tau蛋白聚集蔓延，并再现Tau蛋白病表型特征，包括特征性转录组改变、自噬体积累和神经元活性降低。结合CRISPR技术，该团队发现了500+ Tau蛋白病的潜在治疗靶点。
4R Tau包含4个微管结合域，在Tau病的发病机制中发挥重要作用。在iPSC来源神经元（i3N）中，4R Tau蛋白表达极低，导致建模困难。为增强其表达，作者通过CRISPR/Cas9基因编辑i3N的MAPT位点（图1A）。WB和免疫荧光均证实纯合子4R Tau的i3N只表达4R Tau（ET3标记），而i3N仅表达3R Tau（RD3抗体）（图1B-C）。另外，在纯合子及杂合子4R Tau的i3N中，磷酸化Tau蛋白和成对螺旋丝表达水平显著提高（图1D-E）。额颞叶痴呆相关的MAPT突变P301S位于第10外显子，展现Tau蛋白高度聚集倾向。研究者利用CRISPR/Cas9将P301S突变引入4R Tau序列（图1A）。为分析P301S突变引起的分子改变，作者对4R和4R-P301S神经元进行了RNA-seq。差异分析和富集分析表明P301S突变所上调的基因在神经元分化和细胞-细胞信号通路中富集（图1F），而下调的基因在细胞器定位、细胞内转运和跨膜转运通路中富集（图1G-H）。
图1. 4R和4R-P301S Tau人iPSC来源神经元的生成和特征
（图源：Parra Bravo C et al., Cell. 2024）
为模拟种子诱导的Tau蛋白繁殖，作者利用K18原纤维处理4R和4R-P301S神经元（图2A）。结果表明原纤维处理仅诱导4R-P301S神经元中产生MC1阳性包裹体（致病性Tau蛋白），且MC1阳性包裹体随处理时间延长而增加，模拟了模板诱导错误折叠蛋白的繁殖（图2B-D）。进一步分析发现，MC1+包涵体对针对低聚物和磷酸化的抗体具有免疫反应性（图2E）。透射电镜显示4R-P301S神经元体中具有典型的纤维Tau结构（图2F-G）。作者还分析了内含物的生化性质，在4R神经元中，大部分Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白出现在Triton可溶性部分而非SDS裂解液中。而在4R-P301S神经元中，种子诱导显著降低了Triton可溶性部分的磷酸化Tau蛋白水平，而升高了SDS裂解液中的Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白水平（图2H-I）。而后，作者使用含有MC1抗体的流式细胞术定量检测Tau蛋白包涵体阳性细胞。在原纤维播种后的第21天和第42天，4R-P301S神经元中MC1+神经元的百分比增加了数倍，反映了种子诱导的Tau蛋白繁殖（图2J-K）。
图2. 模拟人类神经元中种子诱导的4R-P301S Tau包涵体
（图源：Parra Bravo C et al., Cell. 2024）
为分析Tau蛋白包涵体引起的细胞机制改变，作者利用透射电镜比较了有无K18播种的4R和4R-P301S神经元亚细胞结构。在经原纤维处理的4R-P301S神经元中，观察到具有多层膜的异常囊泡结构显著积累（图3A-B），类似多层膜小体（MLBs），即包含多个溶酶体起源的同心膜层的细胞器。在含有Tau包涵体的4R-P301S神经元中，MLBs积累提示内溶酶体膜运输功能失调。由于溶酶体的胞吐作用与错误折叠的蛋白聚集物扩散有关，作者推断溶酶体融合受损与种子诱导的Tau蛋白繁殖有关。为证实这一猜想，作者通过过表达显性阴性VAMP7（VAMP7DN）来抑制VAMP7的活性，阻断溶酶体融合（图3E）。结果发现干扰VAMP7介导的膜融合显著减少了KCl诱导去极化后释放的细胞外Tau蛋白，并导致MC1+ Tau包涵体细胞数量显著增加（图3F-I）。上述结果均支持内溶酶体功能障碍与4R-P301S神经元中种子诱导的Tau蛋白繁殖密切相关。
图3. 4R-P301S神经元中的Tau蛋白繁殖与内吞酶体功能障碍有关
（图源：Parra Bravo C et al., Cell. 2024）
Tau蛋白病理与认知能力下降密切相关。由于难以在活神经元中标记Tau蛋白包涵体，Tau蛋白包涵体对神经元功能的影响仍不明确。作者使用CRISPR-Cas9基因编辑技术在4R-P301S序列中插入了一个HaloTag（图4A）。当HaloTag与合成配体结合后，HaloTag发生构象变化，并在特定波长下发出荧光，实现了内源性Tau分子的活细胞成像（图4B）。为了同时监测神经元活动，作者将钙传感器编码基因转入4R-P301S神经元（图4C）。与缺乏包涵体的神经元相比，有包涵体神经元的峰值振幅显著下降（图4D）。作者利用氯化钾灌注诱导慢性去极化，以测量诱发反应（图4E）。有包涵体的神经元迹线峰值高度明显低于缺乏包涵体的神经元（图4F-G）。综上，在含有Tau蛋白包涵体的神经元中，自发性和刺激性诱发的神经元活性均降低。神经元活动促进Tau蛋白的释放。为了直接研究神经元活性对Tau蛋白种植和播散的影响，作者利用mCherry-hM4Di慢病毒（抑制神经元放电）感染4R-P301S HaloTag神经元，然后进行K18播种（图4H-I）。结果发现诱导沉默的神经元中Tau蛋白包涵体水平显著降低（图4J）。综上，神经元活动促进神经元中种子诱导的Tau蛋白繁殖。
图4. Tau包涵体损害自发性和诱发的神经元活动
（图源：Parra Bravo C et al., Cell. 2024）
为鉴定Tau蛋白繁殖的遗传修饰因子，该团队设计4R P301S iPSC稳定表达dCas9，使用Tau低聚物修饰因子相关CRISPRi sgRNA文库转染4R-P301S-dCas9 iPSC，诱导iPSC分化为神经元，在第7天进行K18播种，第19天收集神经元，进行MC1相关染色，筛选出MC1+神经元和MC1-神经元，通过二代测序确定sgRNA频率（图5A）。确定了500+ 种子诱导Tau蛋白繁殖相关的修饰基因，涉及线粒体基因，UFMylation、内溶酶体生物发生和运输等（图5B-C）。为验证这些结果，作者在4R-P301S神经元中敲除VPS29（最强的修饰剂之一）。K18播种三周后，敲除VPS29显著增加MC1+内含物数量（图5D-G），证实VPS29在该4R tau蛋白病模型中是Tau蛋白繁殖的主要修饰因子。
图5. 通过CRISPRi筛选鉴定Tau蛋白包涵体相关修饰物
（图源：Parra Bravo C et al., Cell. 2024）
接下来，研究团队选择了UFMylation级联中的主要候选基因（UBA5和UFM1）来验证其对Tau蛋白包含物的影响（图6A）。结果发现敲减UBA5和UFM1均可显著减少种子接种后MC1+神经元数量（图6B-E）。而后，作者比较了4R-P301S神经元接受种子接种与否的Triton裂解液和SDS裂解液中UFMylation的水平，结果发现仅在4R P301S神经元种子接种后的SDS裂解液游离UFM1显著减少（图6F-G）。为挖掘其潜在机制，作者研究了在不经受种子播种的4R-P301S神经元中下调UFM1对Tau蛋白稳态水平的影响。敲减UBA5和UFM1显著降低了4R-P301S神经元中Tau蛋白水平（图6H-J）。上述结果表明抑制UFM1降低了可溶性稳态Tau蛋白，这可能是4R-P301S神经元中种子接种后Tau蛋白繁殖减少的基础。
图6. CRISPRi筛选确定了UFMylation通路是Tau蛋白包涵体的关键调节因子
（图源：Parra Bravo C et al., Cell. 2024）
该团队利用动物模型进一步探索了UFMylation在体内对Tau蛋白繁殖的影响。作者在PS19小鼠海马中注射慢病毒敲减Uba5（图7A-B）。单侧注射Tau原纤维，触发Tau蛋白聚集物对侧扩散（图7C-D）。与对照组相比，Uba5敲减显著减少了对侧Tau蛋白聚集物的数量（图7E-F）。该团队还研究了4R Tau蛋白病患者的UFMylation情况。在进行性核上麻痹（PSP）和阿尔兹海默症（AD）患者脑内均发现MC1+缠结神经元表现出较低水平的游离UFM1（图7G-J），与体外细胞模型结果一致。上述结果均支持UFMylation可以促进PSP和AD相关的Tau蛋白病理改变。
图7. 在小鼠模型和人脑组织中UFMylation与Tau蛋白病理相关
（图源：Parra Bravo C et al., Cell. 2024）
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