eLife︱李天晴/张润瑞/朱楚洪团队合作解析人脑海马神经干细胞在不同年龄和损伤状态下的类群异质性和分子动态变化

【经环路主题系列】技能培训班，详见文末

撰文︱姚俊君

审阅︱张润瑞

责编︱王思珍

学习与记忆的能力伴随哺乳动物一生，其结构基础根植于发育期及成年期的神经发生过程。大脑海马齿状回是神经发生的一个重要场所，通过储存的神经干细胞维持着神经发生[1]。在啮齿类的研究中发现，神经发生随着年龄的增长逐渐下降，但在成年动物大脑中的特定区域，如侧脑室和海马齿状回等，仍可观察到较为活跃的神经干细胞类型[2]。然而，成年人类大脑海马体中是否存在神经发生，长久以来一直是科学家们争相探索的问题[3][4]。 由于人类捐献脑组织的稀缺与分析技术的限制，这个问题目前没有研究能完全回答清楚。传统的组织染色技术由于样本处理和灵敏度限制，部分研究没有观察到成年人海马体中的神经发生现象[5]。但随着单细胞测序技术的进步，越来越多的研究开始揭示成年人海马体的神经发生现象[6][7]。尽管如此，成年人海马体中神经干细胞的具体类型及其在不同生理状态下的分子机制仍然是一个未解之谜。

近日，由省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室/昆明理工大学灵长类转化医学研究院季维智教授领衔的李天晴教授、张润瑞副教授研究团队和第三军医大学朱楚洪教授研究团队在eLife上发表了题为“Deciphering molecular heterogeneity and dynamics of human hippocampal neural stem cells at different ages and injury states”的文章。该文章通过单核转录组测序技术构建了人类大脑海马体从出生到成年、老年以及损伤过程中的单细胞转录组图谱，并通过组织免疫荧光染色对部分细胞类型进行了验证。研究揭示了人类海马体神经干细胞在不同生理状态下的分子异质性，并提供了海马体神经干细胞类型及其标志性基因的信息。该研究工作能够为理解人类海马成体神经再生的潜力及其调控机制提供新的见解。（拓展阅读：季维智/李天晴课题组往期进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：npj Parkinsons Dis︱李天晴/季维智团队利用基因工程化间充质干细胞成功治疗帕金森疾病模型取得重要进展）

为了构建出生后人脑海马体单细胞转录组图谱，研究人员收集了10个出生后的人类海马体捐献组织样本，包括新生、成年、老年和损伤样本进行核转录组测序。测序获得99635个细胞核信息，质控后平均每个细胞核包含3001个基因（图1A）。通过单细胞分析技术，研究将人类海马体细胞划分为16种细胞类型，包括：星形胶质细胞（AS）、静息态神经干细胞（qNSC）、预备态神经干细胞（pNSC）、活跃态神经干细胞（aNSC）、新生神经元（NB）、颗粒神经元（GC）、中间神经元（IN）、椎体神经元（Pyr）、少突胶质前体细胞（OPC）、少突胶质细胞（OL）、小胶质细胞（MG）、内皮细胞（Per）、Cajal-Retzius 神经元 （CR），以及两种尚未明确的细胞类型（图1B-C）。 

图1.人类大脑海马体在出生后不同年龄和损伤状态下的单细胞核转录组图谱

过去科学家们常常困惑于出生后人脑海马体是否存在显著的神经发生过程，以及存在哪些神经发生相关的细胞类型。为了探索这个科学问题，研究人员通过生物信息学分析方法，从出生后人类海马体单细胞测序数据中鉴定了神经发生相关的细胞类型：静息态神经干细胞，预备态神经干细胞，激活态神经干细胞以及新生神经元（图2A）。其中，静息态神经干细胞与星型胶质细胞的基因表达具有高度相似性，但通过神经干细胞和星形胶质细胞参考基因阵列的分值评估可以将二者区分开来，并且静息态神经干细胞还被划分为两个亚型：qNSC1和qNSC2（图2B-D）。研究结果也提供了人脑海马静息态神经干细胞与星型胶质细胞相比较为特异的基因，例如：SLC1A2、GPC5、PTN、ST18、IL1RAPL1等（图2E-F）。

图2. 人脑海马神经干细胞类群及基因表达特征解析

人神经干细胞发育谱系特异性标志基因的缺乏是阻碍探索人脑海马成体神经发生的重要因素。研究人员通过两种生物信息学分析方法single-cell Hierarchical Poisson Factorization（scHPF）和seurat analysis（FindAllMarkers）鉴定出来人脑海马静息态神经干细胞、预备态神经干细胞、活跃态神经干细胞，新生神经元等类群的特异性表达基因（图3A-B）。例如，静息态神经干细胞高表达LRRC3B、RHOJ、SLC4A4、GLI3；预备态神经干细胞特异性高表达CHI3L1、EGFR; 新生颗粒神经元高表达STMN1、STMN2、NRGN、NRN1等。然而，传统的从啮齿类神经发生中鉴定的新生颗粒神经元特异性基因DCX却在人的中间神经元中也高表达（图3C）。因此，研究人员提出人脑海马新生颗粒神经元的基因表达情况明显有别于啮齿类，并且提供了人脑海马新生颗粒神经元特异性表达的基因，例如：TERF2IP、CALM3、NRGN、FXYD7、NRN1、GNG3等（图3D）。

图3. 人脑海马神经干细胞和新生神经元新型标志物鉴定

为了探索人刚出生时大脑海马体神经干细胞谱系的发育状态，研究人员通过免疫组织染色技术发现人类刚出生时期存在明显的神经发生相关的细胞类型（图4A），并且通过RNA-velocity分析方法预测了刚出生时期的预备态神经干细胞有两条发育路径。一条路径是逐渐进入静息状态或产生星型胶质细胞，另一条路径是产生神经前体细胞，进而发育为神经元（图4B-C）。研究同时展示了这两条发育轨迹富集的重要基因（图4D）。出乎意料的是，在人脑海马中，研究人员观察到海马神经干细胞最终产生了两个不同分支的颗粒神经元谱系，这与小鼠中情况有所不同，需要进一步验证。 

图4. 新生儿海马神经干细胞发育轨迹解析

然而进入成年和老年阶段以后，预备态神经干细胞和活跃态神经干细胞以及新生神经元数量骤降，但静息态神经干细胞在整个神经发生谱系中的比例却随年龄逐渐增长（图5A-B）。在衰老过程中，神经干细胞逐渐上调与静息态和星型胶质细胞发育相关基因，下调与增殖和神经发生相关基因（图5C-D），表明大多数神经干细胞在衰老过程中进入深度静息或趋向于分化为星型胶质细胞，从而失去了它们的神经发生潜力。这一现象与在啮齿类动物中的观察较为相似。

图5. 衰老过程中人脑海马神经干细胞谱系的变化特征

大脑神经干细胞的稳态受到微环境的调控。在小鼠中损伤刺激可以促进静息态神经干细胞的再激活而后分化成新生神经元。为了探索人的大脑中是否存在这样的现象，研究人员分析了在中风损伤的人脑海马体中神经干细胞谱系的变化，发现静息态神经干细胞在中风损伤的海马组织中数量降低，反而预备态神经干细胞和活跃态神经干细胞的数量相比于正常成年人和老年人明显上升（图6A-B）。这些结果表明，中风损伤可能刺激了静息态神经干细胞重新激活转化成预备态神经干细胞和活跃态神经干细胞。遗憾的是，可能由于时间不够或者微环境没有进一步支持，研究人员并没有观察到这些激活的神经干细胞能进一步发育为新生神经元。研究同时还筛选出了神经干细胞激活过程中显著变化的基因，例如：TNC、GPC6、VMP1、CHI3L1、VIM、CD63等（图6C）。调控这些基因的表达或将促进损伤后神经干细胞的激活和神经再生。

图6. 中风损伤引起神经干细胞激活及转录组特征变化

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究揭示了出生后人类大脑海马体神经干细胞在不同生理状态下的分子异质性，并且深入探索了人类神经干细胞在发育、静息、和激活过程中的关键基因，这有可能帮助回答为什么检测成年人海马体神经发生非常困难的原因，同时为理解人类海马成体神经再生的潜力及其调控机制提供新的见解和线索。然而，该研究明显受限于组织捐献者的样本数量不充足，以及健康程度和生活习惯记录不够清晰。未来或将结合表观遗传组学，蛋白组学，代谢组学进一步探索出生后人脑海马体神经干细胞和新生神经元的详细特征和生物学功能。

原文链接：https://doi.org/10.7554/eLife.89507.4

昆明理工大学灵长类转化医学研究院李天晴教授、张润瑞副教授和第三军医大学朱楚洪教授为该论文的共同通讯作者。昆明理工大学灵长类转化医学研究院姚俊君博士，代绍兴教授和朱然博士，以及第三军医大学谭菊高级实验师为本论文的共同第一作者。研究得到了国家重点研发项目、国家自然科学基金、科技创新2030-“脑科学与类脑研究”计划、云南省科技重点研究项目和基础研究项目等项目支持。

通讯作者简介：李天晴，昆明理工大学灵长类转化医学研究院教授，课题组长，博士生导师。主要从事灵长类胚胎发育和干细胞多能性研究，首次建立了人囊胚的三维体外延长培养体系。首次建立了猴全能胚胎干细胞系，获得世界首例嵌合猴，系统研究并揭示了灵长类干细胞的嵌合机制；揭示特异调控灵长类大脑发育的新机制；建立了一套具有知识产权的干细胞高效分离、培养、标准化和规模化的扩增、定向分化以及干细胞体内再生等体系。利用灵长类动物疾病模型，在干细胞治疗帕金森疾病和脊髓损伤的临床前研究上取得了重要的突破，促进了神经系统疾病的干细胞治疗药物的研发，推动了干细胞转化应用。获得国家科技部重点研发专项、自然科学基金重点项目、云南省万人计划高层次人才“云岭学者”等支持。近几年以通讯作者在Nature、Cell Stem Cell、Cell research、Science Advances、Cell Reports、Stem Cells Reports、Biomaterials等国际著名杂志上发表了20余篇高水平论文，研究成果被Cell、Nature、Cell Stem Cell等国际一流杂志引用。

通讯作者简介：张润瑞，昆明理工大学灵长类转化医学研究院副教授，省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室课题组长。主要从事哺乳动物神经发生和神经再生的调控机制和功能研究。其研究成果发表在Cell Stem Cell，National Science Review，Cell Reports，Cell Tissue Res等国际知名杂志上。获得国家自然科学基金面上项目、科技创新2030-“脑科学与类脑研究”重大项目青年项目、云南省“兴滇英才”青年人才项目支持计划、云南省基础研究专项面上项目等支持。

通讯作者简介：朱楚洪，国家杰青、国家重点研发计划项目首席、中国解剖学会血管分会主任委员。现任陆军军医大学组织器官再生与制造教育部工程研究中心主任，重庆市器官智能生物制造工程研究中心主任。从事工程血管及复杂组织器官构建研究，获国家自然科学基金重点项目、产学研等十余项课题资助。近年来以通讯作者 (含共同)在Science Advances，ACS Nano，Biomaterials等杂志发表IF10.0以上SCI论文22篇。研发了新型生物人工血管、心脏修复材料、血管化类器官等系列血管化工程产品和技术。申请及获批发明专利30项，PCT专利5项，软件著作权5项，制定医疗器械产品技术要求17项，技术支撑获得Ⅲ类医疗器械注册证等产品证书17个。

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扫码添加微信，并备注：逻辑-文献-姓名-单位-研究领域-学位/职称（注：不按要求格式备注，则不通过好友申请）参考文献 [1] Berg, D. A., Y. Su, D. Jimenez-Cyrus, A. Patel, N. Huang, D. Morizet, S. Lee, R. Shah, F. R. Ringeling, R. Jain, J. A. Epstein, Q. F. Wu, S. Canzar, G. L. Ming, H. Song, and A. M. Bond. 2019. "A Common Embryonic Origin of Stem Cells Drives Developmental and Adult Neurogenesis." Cell 177 (3): 654-668 e15. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.02.010. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30929900.[2] Hochgerner, H., A. Zeisel, P. Lonnerberg, and S. Linnarsson. 2018. "Conserved properties of dentate gyrus neurogenesis across postnatal development revealed by single-cell RNA sequencing." Nat Neurosci 21 (2): 290-299. https://doi.org/10.1038/s41593-017-0056-2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29335606.[3] Kempermann, G., et al., Human Adult Neurogenesis: Evidence and Remaining Questions. Cell Stem Cell, 2018. 23(1): p. 25-30.[4] Tosoni, G., et al., Mapping human adult hippocampal neurogenesis with single-cell transcriptomics: Reconciling controversy or fueling the debate? Neuron, 2023. 111(11): p. 1714-1731 e3.[5] Sorrells, S.F., et al., Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature, 2018. 555(7696): p. 377-381.[6] Wang, W., et al., Transcriptome dynamics of hippocampal neurogenesis in macaques across the lifespan and aged humans. Cell Res, 2022. 32(8): p. 729-743.[7] Zhou, Y., et al., Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan. Nature, 2022. 607(7919): p. 527-533.

编辑︱王思珍
本文完