SYNJ1，作为帕金森病（PD）致病基因之一，负责编码Synaptojanin-1（SJ1）——一种在神经元中富集的PI（4,5）P2 4-和5-磷酸酶，参与内吞过程中内吞因子的脱落。该基因Sac结构域的一种突变（R258Q）选择性地破坏了其4-磷酸酶活性，可导致人类PD和小鼠（SJ1RQKI小鼠）神经缺陷。动物研究表明，SJ1RQKI小鼠表现出与PD患者相似的神经学表现，除了突触处内吞因子的异常组装状态外，还伴随着背侧纹状体多巴胺能（DA）神经末梢退行性变，提示DA神经元对SJ1功能损伤具有特殊不稳定性。近日，美国耶鲁大学医学院神经科学系Nisha Mohd Rafiq团队在PNAS上发表了题为“Parkinsonism Sac domain mutation in Synaptojanin-1 affects ciliary properties in iPSC-derived dopaminergic neurons”的研究论文，在该研究中，作者利用iPSC衍生的SJ1 KO和SJ1RQKI DA神经元深入研究了SJ1对DA神经元的影响。除了预期的神经末梢内吞因子聚集增强外，作者在SJ1突变神经元系中观察到纤毛长度增加。SJ1RQDA神经元纤毛分析发现Ca2+通道Cav1.3和泛素链的异常积累，提示纤毛碱基泛素化蛋白清除存在缺陷，因此，作者提出SJ1可能有助于DA神经元中纤毛蛋白动力学的控制，并参与纤毛介导的信号转导。首先，作者通过CRISPR/Cas9敲除人iPSCs（WTC11系）SJ1（SJ1 KO）表达，从the iPSC Neurodegeneration Initiative (iNDI)获取携带R258Q突变的iPSCs（KOLF2.1系），诱导SJ1 KO和SJ1RQKI诱导多能干细胞及其相应的等基因对照组分别分化为皮质样i3神经元或DA神经元。动物模型中最关键的表型为，在SJ1 KO和SJ1RQKI神经元的神经末梢中，内吞膜中间体和内吞因子显著积聚，包括网格蛋白外壳成分及其附件组成，该团队利用iPSC-衍生的DA神经元作为模型复现了该表型改变。作者进一步使用微流控区段化装置（eNuvio）将SJ1RQKI DA神经元与iPSC衍生的中棘神经元（MSNs）共培养时，也可观测到该表型。因此，iPSC衍生的DA神经元可作为研究SJ1突变表型的良好模型。图1. SJ1 KO和SJ1RQKI iPSC衍生DA神经元表现出amphiphysin-2的突触前聚集。（图源：Mohd Rafiq N et al., PNAS. 2024）一个受PI4P和PI4P（4,5）P2动态调节的细胞成分为初级纤毛，其被认为是主要的信号中枢，影响神经元的功能。作者进一步探索了SJ1损伤是否对纤毛功能造成扰动，以及这种扰动是否发生在DA神经元中。初级纤毛标记物Arl13b在未分化的iPSC中清晰可见，在分化为皮质样i3神经元后不再检测到，而分化为DA神经元后仍保留Arl13b+纤毛；同时，在DA神经元中，acetylated tubulin（一般纤毛标记物）和AC3（神经元纤毛特异性标记物）也呈阳性。（图源：Mohd Rafiq N et al., PNAS. 2024）通过对Arl13b、acetylated tubulin和AC3免疫标记的评估，SJ1 KO神经元的纤毛几乎是对照组的两倍长。此外，在SJ1 KO DA神经元中观察到异常形状的Arl13b+纤毛，但在对照组中未发现。在SJ1RQKI DA神经元及其对照组中观察到类似的表型。以上结果表明缺乏功能性SJ1会影响DA神经元纤毛的某些特性。图3. SJ1 KO iPSC衍生DA神经元表现出相较于对照组异常的纤毛长度。（图源：Mohd Rafiq N et al., PNAS. 2024）图4. SJ1RQKI iPSC衍生DA神经元表现出相较于对照组异常的纤毛长度。（图源：Mohd Rafiq N et al., PNAS. 2024）DA神经元的一大特性是其内在起搏器功能，其活性高度依赖于L-型Cav1.2和Cav1.3电压-门控钙通道。这些通道广泛表达于神经元的细胞体和树突表面，也存在于一些细胞的纤毛或纤毛衍生结构中。作者利用抗Cav1.3抗体证实了iPSC在iPSC衍生DA神经元的纤毛基底部存在Cav1.3通道。在SJ1RQKI DA神经元Arl13b+纤毛轴中，观察到明显增强的Cav1.3荧光强度。这些结果表明，在iPSC衍生的SJRQKI DA神经元中，纤毛不仅在长度上存在异常，而且在某些功能特性上也存在异常。作者使用Fluo-4染料对钙信号特性评估，结果表明，与对照组DA神经元相比，SJ1RQKI DA神经元的自发活性降低。图5. SJ1RQKI iPSC衍生DA神经元纤毛轴存在Cav1.3积累。（图源：Mohd Rafiq N et al., PNAS. 2024）纤毛中膜蛋白周转的一个主要机制是膜蛋白泛素化（通过与UbK63连接），这一过程控制着膜蛋白从纤毛中的退出。因此，该团队研究了泛素偶联物（FK2和FK1标记）在纤毛中的表达情况，在对照细胞纤毛中未检测到FK2和FK1信号，而在SJ1RQKI DA神经元纤毛中检测到FK2和FK1强信号，这一结果揭示了SJ1功能与DA神经元纤毛膜蛋白清除之间的联系。图6. SJ1RQKI iPSC衍生DA神经元纤毛存在泛素偶联物积累。（图源：Mohd Rafiq N et al., PNAS. 2024）SJ1突变可通过损伤整个神经元表面内吞作用或改变纤毛附近特定功能对初级纤毛造成影响。作者通过免疫荧光技术评估了SJ1在分化为DA神经元前后的胞内定位。结果表明，在未分化的iPSC和对照组DA神经元中，有一到两个SJ1与中心粒标记物γ-tubulin共定位。在SJ1 KO iPSC和SJ1 KO DA神经元中，纤毛基部的SJ1染色丢失。SJ1在中心粒上的定位支持了SJ1在纤毛中的作用。图7. 在iPSCs和iPSC衍生DA神经元的纤毛基部存在一个SJ1池。（图源：Mohd Rafiq N et al.,PNAS. 2024）RPE1细胞系是一种进行纤毛分析的常用模型。该细胞系经血清饥饿48h可诱导纤毛发生。在这些细胞中表达mCherry-SJ1-145或GFP-标记的SJ1-170（SJ1的短和长形式）后，在初级纤毛的底部观察到mCherry和GFP荧光亮点。在这些细胞中，mCherry-SJ1-145与纤毛轴组成成分（GFP-INPP5E）的表达情况证实了SJ1在纤毛基底部的定位。（图源：Mohd Rafiq N et al.,PNAS. 2024）SJ1中Sac1结构域的突变可导致早发型帕金森病。该研究发现这种突变可影响iPSC衍生多巴胺能神经元的纤毛特征。SJ1功能丧失可使多巴胺能神经元纤毛长度增加，并导致Cav1.3通道和泛素链在整个纤毛轴中的积累，这些发现揭示了纤毛介导信号通路与帕金森病之间的联系。已有研究提出初级纤毛动力学在帕金森病的发病机制中的作用。SJ1突变DA神经元中纤毛的异常特征如何影响其功能以及其在PD发病机制中的具体作用有待进一步研究。原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2318943121
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