知否，知否，结直肠癌的真菌组研究
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文章速递
之前的研究已表明，肠道的细菌和病毒的变化都与结直肠癌（colorectal cancer， CRC）相关。本文作者收集了来自香港的 184 名 CRC 患者、197 名腺瘤患者和 204 名对照的粪便样本进行了宏基因组测序。
与健康人群相比，本研究发现病人中存在与 CRC 相关的粪便真菌的生态失调：担子菌门（Basidiomycota）/子囊菌门（Ascomycota）比例增加；在纲（class）水平，CRC 病人的肠道微生物中富含 Malasseziomycetes，而几乎不含有半子囊菌纲（Saccharomycetes，酵母）和肺孢子菌纲（Pneumocystidomycetes）。
从样本中鉴定出来的 CRC 相关真菌标志物和生态变化也在欧洲 CRC 患者研究队列中得到验证。这 14 个真菌 biomarker 的丰度可将病人和健康人群分开，ROC（receiver-operating characteristic）曲线的 AUC ( Area Under the Curve ) 为 0.93，同时在本研究的验证队列和欧洲 CRC 研究队列中 AUC 分别为 0.82 和 0.74。
与对照相比，CRC 患者的真菌间存在更高的共存性，以及真菌和细菌之间存在更高的排斥性。表明真菌的协同作用和细菌-真菌的拮抗生态关联可能在结直肠癌发生中发挥作用。
关键字: Mammalian gut microbiota, Transmission modes
Title: Enteric fungal microbiota dysbiosis and ecological alterations in colorectal cancer
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DOI: 10.1136/gutjnl-2018-317178
Journal: Gut [IF 17.016]
First Authors: Olabisi Oluwabukola Coker
Correspondence: Jun Yu
Affiliation: The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
Published: 2018-11-28
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研究背景
之前的研究表明 CRC 患者提供的肠道微生物群可以在小鼠模型中诱导肿瘤发生。且肠道微生物中的细菌和病毒改变已被证实与 CRC 相关。然而肠道真菌与 CRC 的关系还未被研究，其中一部分原因是真菌的丰度相对较低且缺乏合适的参考基因组。
尽管根据估计在哺乳动物的微生态环境中，真菌只占不到 1%，但已有 4 项研究表明它在肠道中的重要性。肠道真菌群落和多样性的变化最近被研究发现与人类的 IBD 和肝硬化相关。此外，在小鼠模型中已发现，共生真菌会替代肠道菌群以维持宿主的肠道免疫反应潜力来逆转细菌消亡导致的宿主疾病易感。
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研究结果
2.1 肠道真菌失调与 CRC 相关
① 与本文作者之前的研究结论一致，在 CRC 病人中，肠道细菌的 alpha 多样性显著降低；Beta 多样性能将健康人和病人显著区分。
② 而真菌，alpha 多样性和物种丰富度在病人和健康人中不存在差异（图1D）。但 Rarefaction 图结果显示在病人和健康人中曲线都趋于平缓，即当前测序量已满足全部真菌物种被测序。
③ 无监督主成分分析（PCA）和监督冗余分析（RDA）均显示肠道的真菌微生态（mycobiome）能将病人和健康人分成显著差异的两簇（图1AB）。真菌丰度的RDA结果中能观察到健康人、CRC 早期和 CRC 晚期样本聚类成不同的簇（图1C），说明存在与 CRC 发展过程相关的真菌微生态破坏。
图 1. CRC 发现队列中肠道真菌变化 A) PCA ; B) RDA ; C) 不同阶段 CRC 的 RDA ; D) 发现队列的真菌丰富度和香农指数。
2.2 CRC 中的肠道菌群物种变化
① 与之前的研究结论一致，观察到 CRC 与健康人相比梭杆菌门的富集和厚壁菌门的消耗。
② 在真菌分类群中，子囊菌门在真菌群中占主导地位，担子菌门为第二丰富的门（图2A）。此外，根据之前的研究，反映真菌生态失调的担子菌 / 子囊菌比率在 CRC 中病人更高。
③ 在纲水平，CRC 病人的肠道微生物中富含 Malasseziomycetes，而几乎不含有半子囊菌纲（Saccharomycetes，酵母）和肺孢子菌纲（Pneumocystidomycetes）（图2C）；在科水平，Lipomycetaceae 在 CRC 中显著减少，而Pisolithaceae、Marasmiaceae、Malasseziaceae、Erysiphaceae、Pseudorotiaceae 和 Chaetomicaeae增加（图2D）；在属水平，CRC 患者中 Malassezia、Moniliophthtora、Rhodotorula、Acremonium、Thielaviopsis 和 Pisolithus 显著增加。
图 2. A) 主要的真菌门在病人和健康人群的相对丰度情况；B) 担子菌 / 子囊菌比率；差异分析的结果; C) 纲水平; D) 科水平; E) 属水平。
2.3 真菌物种作为 CRC 诊断标志物
在对混杂因素（即年龄，性别和 BMI）进行校正后，与对照组相比，观察到 38 种真菌物种的丰度在 CRC 中显著不同。其中 29 个是在 CRC 患者中富集的，而其他 9 个是在 CRC 患者中降低的（图3A）。其中变化倍数大于 2 的物种被认为具有诊断潜力，这些标记物将 CRC 和对照区分的 AUC 为 0.93。区分对照与早期 CRC 的 AUC 为 0.91。
图 3. A) 标记物在对照和病人中的相对丰度热图；通过逻辑回归建立的真菌标记物分类模型在；B) 病人与对照； C) 对照与早期病人中的验证表现。
在独立的中国队列 V1 中进行了验证，其中包括 112 个对照、197 个腺瘤患者的和 111 个 CRC 患者的样本。真菌标记物可以明显地区分对照和 CRC 病人，其 AUC 为 0.82，并且区分早期 CRC 病人和对照的 AUC 为 0.81（图4A）。在种族不同的欧洲队列 V2（包含了德国和法国两个国家的 66 个对照和 90 个 CRC 病人，32 个为早期 CRC 样本）中得到验证，区分 CRC 和早期 CRC 的 AUC 分别为 0.74 和0.72。然而对于 V1 和 V2 队列中的腺瘤样本，这些真菌标记物区分的 AUC 仅有 0.63 和 0.6（图4A，B）
图 4. 在独立人群中验证模型的结果 A) 中国独立人群V1；B) 欧洲独立人群 V2。
2.4 CRC 中的界内和跨界的生态网络扰动
文章通过估计真菌内部和细菌-真菌间的相关性来研究结肠直肠肿瘤中多种微生物生态的相互作用。
① 对真菌内部，在 CRC 中具有显著更多的积极和更强的相互作用（p <0.0001，图5A）
② 健康人和病人的细菌-真菌关联性网络显著不同，在健康人中，存在少且正相关的细菌-真菌相关，在病人中，存在更多更强的拮抗细菌-真菌关系。
③ 在健康人中发现的共生真菌 Leotimycetes, Sodariomycetes 和 Eurotiomycetes 出现在了病人的细菌-真菌拮抗关系中，表明肠道微生物体内稳态与健康受试者中平衡和协同的细菌-真菌跨界关系相关。
④ CRC 中增强的真菌内共生和细菌-真菌拮抗网络在V1（p = 0.004414）和V2（p = 0.00006；p <0.00001）队列中得到验证。
总之，这些结果表明肠道中的真菌和细菌之间存在复杂的关系，它们的拮抗作用可能促进了结直肠癌的发生。
图 5. 病人与健康人之间界内和跨界网络分析；关联性是通过 SParCC 计算，绝对值大于 0.3 被认定为显著相关； A) 病人比对照组存在更多的共生真菌；B) 病人和对照组之间的跨界（细菌-真菌）网络结果。
2.5 科水平丰度差异的细菌和真菌之间的生态关联
为了更细致地发掘细菌和真菌之间的关联，本文进行了科水平的细菌丰度差异分析。
① 在对照中，观察到真菌 Chaetomiaceae 和细菌 Ruminicoccaceae 之间以及真菌 Pseudeurotiaceae 与细菌 Alteromonadaceae 和 Geobacteraceae 之间的协同作用（图5B）；反映了跨界的协同相互作用对肠道微生物群稳态的贡献。
② 随着细菌 Geobacteraceae、Synergistaceae、Peptoniphilacea 和 Fusobacteriaceae的富集，真菌 Chaetomiaceae 和细菌 Ruminicoccaceae、真菌 Pseudeurotiaceae 和细菌 Alteromonadaceae 之间的正相关性都消失了。在 CRC 中，降低的细菌家族与富集的真菌家族形成显著的拮抗作用。
③ 而富集的细菌家族如 Fusobacteriaceae，Synergistaceae 和 Peptoniphilaceae 与 CRC 中富集或耗尽的真菌家族没有显著相关。这与之前研究结果一致，即细菌中的生态失调可能会增强 CRC 中某些真菌家族的定植。
④ 在 CRC 中富集的真菌形成了强相关的网络，这在对照中是不存在的。
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讨论与总结
① 文章中发现的在 CRC 中富集的 6 个真菌属 ，其中 Acremonium 是已被证实的机会病原体，潜伏在从人的液体中，例如血液，痰液和气管吸出物。而 Rhodotorula 是一种能够定殖，感染和破坏肠道基本的微生物群落的新型病原体。
② 真菌纲 Saccharomycetes 和属水平的 Lipomyces starkeyi 和 S.cerevisiae 在 CRC 中降低。S. cerevisiae 是人类肠道微生物群的主要成分，已被证明可以减少小鼠模型中粘附性大肠杆菌诱导的回肠结肠炎。
③ 健康肠道中的真菌和细菌之间存在复杂的生态网络，在 CRC 病人中基本上被破坏。虽然真菌中的相关网络在 CRC 病人中变得更加阳性，但真菌和细菌之间的相关网络基本上都是拮抗的，这可以为真菌提供有利于真菌内相互作用的条件，让它们对 CRC 发生产生影响。
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M 菌说
宏基因组中的真菌分析
① 去掉低质量和 adapter 之后的 reads 被比对到常用哺乳动物的基因组、6877 个细菌质粒、2116 个质体基因组和 6093 个载体基因组，去掉比对上的序列。
② reads 之后被比对到自建的数据库：收集了 7505 个细菌和 1083 个真菌基因组（来自NCBI、FungiDB、Ensemble和 Broad）并利用 Jellyfish 构建了 31-mer 的数据库；最终利用 R 的 metagenomeSeq R / Bioconductor 包的 cumulative sum scaling 方法进丰度计算。
参考文献
1. Moeller A H, Suzuki T A, Phifer-Rixey M, et al. Transmission modes of the mammalian gut microbiota[J]. Science, 2018, 362(6413): 453-457.
撰稿 | Yiqi
责编 | NSC
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