【科讯】再次取得新突破！施一公研究组再发一篇Science

大约1％的人类基因组包含所谓的U12型内含子，这些内含子由次要剪接体剪接而成。与主要剪接体相比，次要剪接体的组成，组装，功能状态，激活，调节和结构是令人费解的。

2021年3月19日，西湖大学施一公教授研究组在Science 正式发表题为“Structure of the Activated Human Minor Spliceosome”的研究论文，该研究是剪接体结构与机理研究的又一个重大突破。

该研究首次报道了迄今整体研究知之甚少的次要剪接体的高分辨率三维结构，展示了在剪接反应中的一个关键构象——激活态次要剪接体（activated minor spliceosome，定义为“次要Bact复合物”），整体分辨率高达2.9埃。该结构第一次展示了人源次要剪接体的组成、以及对稀有内含子（U12依赖型内含子）的识别机理，首次揭示了次要剪接体的催化中心以及活性位点，并且通过结构解析鉴定了次要剪接体的全新蛋白组分、揭示了它们对次要剪接体及罕见内含子剪接的重要作用等一系列重要科学问题。此次重大突破，使施一公研究组在继2015年首次解析世界上第一个剪接体结构、2017年解析第一个人源剪接体结构之后，再次成为世界上首个解析了次要剪接体高分辨率三维结构的团队。
文章讲了啥？

在高等生物中，一段又一段的遗传密码埋在核酸分子中。其中，“无效”的遗传信息不具有翻译功能，被称为内含子，而可以被核糖体翻译的有效遗传信息叫做外显子。把这些遗传密码中“无效”的内含子“剪”出来，“有效”的外显子“接”到一起的过程叫做RNA剪接，它是生命体解读遗传密码的核心步骤。负责执行这一步骤的就是细胞核内复杂精密的分子机器——剪接体。
每个细胞对于每一条剪接前的基因信使——前体信使RNA的剪接在时空上是非常精准的。剪掉谁，剪掉多长，什么时候剪，按照什么顺序把外显子拼接起来，每一个“操作”都是可能改变细胞命运的关键问题。一步走错，结果千差万别，基因的表达和传递也会因此出现错误，于是就导致了人类某些先天遗传疾病以及后天疑难杂症的出现。研究发现，人类的遗传疾病大约有35%都是因为剪接异常造成的。从1977年首次发现RNA剪接至本世纪初，科学家们通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、建立体外剪接反应系统等研究手段，初步建立起剪接体的组装、激活与解聚的发生过程，以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的相互作用、相互调控等复杂的RNA剪接调控网络。
施一公研究组一直致力于剪接体的三维结构与RNA剪接分子机理的研究，自2015年报道了第一个剪接体的高分辨率三维结构后，相继解析了酿酒酵母和人源主要剪接体（major spliceosome）的全部已被鉴定的基本构象。这些已解析的剪接体覆盖了整个RNA剪接循环，从分子层面揭示了剪接体催化RNA剪接两步反应的工作机理，同时为理解剪接体的组装、激活和解聚等过程的发生提供结构依据，首次将剪接体介导的RNA剪接过程完整的串联起来，为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息（图2）。与此同时，施一公研究组也将目光聚焦在了研究更为匮乏的次要剪接体研究领域。
图2 施一公研究组解析的剪接体结构汇总（图片来源: Wan et.al, 2020, Annu Rev Biochem）
在没有任何次要剪接体的捕获与纯化等相关文献的情况下，摸索并建立次要剪接体的捕获与纯化方法迫在眉睫。施一公研究组的白蕊博士与万蕊雪博士，长期从事剪接体的纯化与结构研究工作，并积累了大量剪接体结构研究的经验。在此研究经验基础之上，结合次要剪接体识别位点的特异性，研究组首次设计出一条全新的U12依赖型的pre-mRNA。通过改良前人的体外剪接反应实验条件，成功地确定了该U12依赖型的pre-mRNA具有极高的特异性与剪接的高效性。由于次要剪接体的含量极低，如何进一步获得性质良好的次要剪接体样品，成为本文研究的第二大难点。白蕊和万蕊雪在原有的剪接体纯化基础之上，进一步探索与改良，最终首次建立起一套完整的次要剪接体捕获与纯化方法，成功获得了处于激活态的次要剪接体的蛋白样品，随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了世界上首个次要剪接体的冷冻电镜结构，整体分辨率为2.9埃，并搭建了第一个次要剪接体的原子模型，其中包含了4条RNA和45个蛋白（图3）。
图3 人源次要剪接体的三维结构
该文解析的人源次要剪接体Bact complex结构，首次观察到了次要剪接体特有组分U6atac snRNA和U12 snRNA的三维结构，揭示了识别U12-type内含子剪接位点的结构基础，第一次展示了次要剪接体活性位点和催化中心的三维结构。在次要剪接体的活性位点中，两个具有关键作用的催化镁离子被周围的RNA配位结合，为剪接反应的发生提供了基础。
该文章西湖大学生命科学学院施一公教授、西湖大学生命科学学院西湖学者万蕊雪博士为本文的共同通讯作者；西湖大学生命科学学院博士后白蕊和西湖学者万蕊雪为本文的共同第一作者；清华大学生命学院博士后王琳参与了部分生化研究；清华大学生命学院博士生徐魁、清华大学生命学院张强锋研究员为结构模型的搭建提供了帮助；清华大学冷冻电镜平台主管雷建林博士为冷冻电镜数据收集提供了帮助。
电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台，计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心（北京）的支持。本项研究成果来自于西湖实验室，获得了西湖教育基金会、北京结构生物学高精尖创新中心（清华）及国家自然科学基金委的经费支持。注：解析参考西湖大学官网介绍。原文链接：https://science.sciencemag.org/content/early/2021/01/27/science.abg0879

文章内容来源于“孜然学术”公众号

编辑：黄琦

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