【期刊】Caulobacter crescentus蔗糖水解酶受体亚位点分子改造及其在松二糖制备中的应用
以下文章来源于合成生物学期刊 ，作者王蕾等
2022年第3期研究论文
Caulobacter crescentus 蔗糖水解酶受体亚位点分子改造及其在松二糖制备中的应用
王蕾，邢晨晨，郭志勇，宿玲恰，吴敬
（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）
引用本文: 王蕾, 邢晨晨, 郭志勇, 宿玲恰, 吴敬. Caulobacter crescentus蔗糖水解酶受体亚位点分子改造及其在松二糖制备中的应用[J]. 合成生物学, 2022, 3(3): 602-615
Citation: WANG Lei, XING Chenchen, GUO Zhiyong, SU Lingqia, WU Jing. Molecular modification of acceptor subsite in sucrose hydrolase from Calobacter crescentus and its application in producing turanose[J]. Synthetic Biology Journal, 2022, 3(3): 602-615
DOI: 10.12211/2096-8280.2021-047
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摘 要
松二糖是由葡萄糖与果糖以α-1,3糖苷键连接而成的还原性二糖，具有代替蔗糖成为新型功能性甜味剂的潜力，在食品工业中应用前景广阔。淀粉蔗糖酶能够以蔗糖为底物催化异构（分子内转苷）反应制备松二糖，产率高但易产生副产物麦芽寡糖和海藻酮糖。为解决这一问题，选用前期获得的松二糖产率高并且不产副产物麦芽寡糖的Caulobacter crescentus 蔗糖水解酶突变体S271A为研究对象，进一步通过受体亚位点分子改造，获得了反应特异性和松二糖产率提升的突变体S271A/I382Q。在此基础上进行了酶转化条件优化，当以2 mol/L蔗糖溶液为底物，加酶量为40 U/mL，在pH 5.0、30 ℃的条件下，松二糖的产率达到最高为70.3%，松二糖的浓度为480 g/L，并且反应产物中不含副产物海藻酮糖。分子动力学模拟表明，突变体S271A/I382Q可通过氢键相互作用稳定受体果糖参与形成α-1,3糖苷键时的构象，从而更有利于生成松二糖。本研究创新性地将蔗糖水解酶改造为键型特异性强的转苷酶，获得的松二糖产率为目前报道的最高水平，为松二糖的规模化制备与应用奠定了理论和技术基础。
全 文
松二糖是蜂蜜寡糖的主要成分之一，是由1分子葡萄糖和1分子果糖以α-1， 3糖苷键连接而成的还原性二糖。松二糖是蔗糖的同分异构体，其甜度为蔗糖的50%，甜味和蔗糖相似。由于松二糖不易被人体生物酶利用，因此具有非致龋齿性和低热量的优点。此外，松二糖还可控制脂肪积累，适合肥胖症、糖尿病、高脂血症和高血压等患者食用，有望代替蔗糖成为新型功能性甜味剂。
目前，松二糖主要由环糊精葡萄糖基转移酶或淀粉蔗糖酶催化制备。已有研究表明，Bacillus stearothermophilus、Bacillus macerans 和Bacillus circulans 来源的环糊精葡萄糖基转移酶可用于制备松二糖，但产率低于45%，并且含副产物海藻酮糖，同时产物中还存在糖基化的松二糖，需要经过糖化酶处理，因此不适合工业化生产。而选用淀粉蔗糖酶制备松二糖产率高，受到青睐。
淀粉蔗糖酶是一种多功能酶，可催化转苷反应和水解反应。其中，转苷反应是其主反应，包含分子内转苷反应和聚合反应，分子内转苷反应又称异构反应（图1）。淀粉蔗糖酶能够通过异构反应转化蔗糖制备松二糖。Wang等使用Neisseria polysaccharea 来源的淀粉蔗糖酶制备松二糖，当蔗糖浓度为2.5 mol/L时，松二糖产率可达56%。宿玲恰等构建了N. polysaccharea 来源的淀粉蔗糖酶突变体G396S，并在食品级菌株枯草芽孢杆菌中成功表达，以2 mol/L的蔗糖为底物时，松二糖产率可达61.7%，产量为410 g/L。尽管采用淀粉蔗糖酶制备松二糖的产率高，但存在副产物麦芽寡糖和海藻酮糖，不利于后续分离提取。目前，N. polysaccharea 来源的淀粉蔗糖酶制备松二糖时，海藻酮糖与松二糖比例最低为0.12或0.21（2%/17%或3%/14%），在反应过程中添加果糖，只能显著降低麦芽寡糖，对海藻酮糖的降低无显著效果。
图1 淀粉蔗糖酶催化的反应类型
蔗糖水解酶和淀粉蔗糖酶同属于糖苷水解酶GH13家族的第4亚家族，序列一致性在30%～55%之间。与淀粉蔗糖酶催化功能相反，蔗糖水解酶可催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，转苷反应微弱。本实验室前期通过机器学习、序列结构分析、实验验证以及QM/MM MD模拟揭示了决定该家族转苷/水解特征的机制，并且获得了Caulobacter crescentus来源的蔗糖水解酶突变体S271A，其具有和淀粉蔗糖酶相似的转苷能力，制备松二糖产率可达55.9%，副产物海藻酮糖产率为9.1%，并且不含副产物麦芽寡糖。因此，本研究以S271A为出发酶，通过蛋白结构分析和分子改造获得反应特异性提升的突变体，并进一步对其制备松二糖的条件进行优化，提高松二糖的产量和纯度，为工业化制备松二糖奠定了技术基础。本研究还对突变体进行了分子动力学模拟分析，为松二糖高效制备酶学机制提供了理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种和质粒
克隆宿主Escherichia coli JM109和表达宿主E. coli BL21（DE3）购自上海生工生物公司并由本实验室保藏，带有S271A基因的质粒pET-24a(+)-ccsh S271A由本实验室构建并保藏。
1.1.2 主要试剂及仪器
试剂：DNA聚合酶2 × Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司；卡那霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉购自英国Oxiod；其他试剂均为国产分析纯，购自国药集团；质粒测序与引物合成由天霖（无锡）生物科技有限公司完成。
仪器：PTC-200型核酸扩增仪购自美国MJ Research；DYY-6C型核酸电泳仪购自北京六一电泳仪厂；电热恒温培养箱购自上海医疗器械研究所；凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；UV-1700紫外可见光分光光度计购自日本Shimadzu公司；Agilent 1200高效液相色谱系统购自美国Agilent公司；超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2 突变体的构建与表达
1.2.1 突变体的构建
以质粒pET-24a(+)-ccsh S271A为模板，对第382位点、第211位点、第273位点和第209位点进行突变。根据突变位点设计引物（表1），采用DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix进行一步PCR，将PCR产物经过Dpn Ⅰ除去模板后转入E. coli JM109，并涂布于含有Kan抗性的LB固体平板过夜培养，挑取单菌落至LB液体培养基中，于37 ℃、200 r/min培养8 h，提取质粒测序验证，获得带有各突变体S271A/I382G、S271A/I382S、S271A/I382T、S271A/I382Q、S271A/I382K、S271A/I382R、S271A/V211I、S271A/P273A、S271A/P273S和S271A/P209R基因的质粒。
表1 定点突变引物
1.2.2 突变体的表达
将含各突变体基因的质粒转入E. coli BL21（DE3）中，并涂布于含有Kan抗性的LB固体平板过夜培养，挑取单菌落至含有Kan抗性的液体LB培养基中，在37 ℃、200 r/min摇床中培养8 h。将种子液按照5%的接种量转接至50 mL含有Kan抗性的TB培养基中，于37 ℃、200 r/min摇床中培养2 h。加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，于25 ℃、200 r/min摇床中培养24 h。发酵结束后，于4 ℃、8000 r/min离心机中收集菌体，用50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH 7.0）重悬菌体至OD600为50后进行高压匀浆破壁，4 ℃、8000 r/min进行离心后收集上清液，并采用硫酸铵沉淀进行浓缩，在酶液中加入0.3 kg/L的硫酸铵粉末，并搅拌溶解，在4 ℃冰箱中放置过夜，然后离心弃上清收集沉淀。用10 mmol/L的pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液重悬沉淀直至溶解，然后放入透析袋中于4 ℃冰箱过夜透析，在4 ℃，8000 r/min的离心机中离心20 min后收集上清用于后续实验。
1.2.3 突变体的纯化
由于重组酶的蛋白末端已经带有His-Tag，所以用镍亲和色谱柱His-TrapTM HP-5 mL对收集的酶液进行纯化。
结合缓冲液（A液）成分：25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，调节pH至7.0。洗脱缓冲液（B液）成分：300 mmol/L咪唑，25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，调节pH至7.0。
先用100 mL的A液将镍亲和色谱柱进行平衡，接着将待纯化的粗酶液进行上样。上样结束后，用100 mL的A液进行冲洗，冲洗结束后，分别用100 mL的5% B液-95% A液混合液、10% B液-90% A液混合液、15% B液-85% A液混合液、100% B液依次进行冲洗，收集洗脱液进行酶活和蛋白含量检测。
1.3 突变体的分析
1.3.1 酶活检测
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活：将1.9 mL 0.3 mol/L的蔗糖溶液（50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 7.0）在30 ℃预热后，加入0.1 mL适当稀释的酶液并混匀，30 ℃反应10 min后，加入3 mL DNS溶液终止反应。然后将反应液在100 ℃水浴中煮沸7 min，迅速放在冰水中进行冷却，最后加入10 mL蒸馏水定容到15 mL，在540 nm处测定光密度。检测不同pH下的酶活时，用不同pH的K2HPO4-KH2PO4缓冲液（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）和不同pH的Na2CO3-NaHCO3缓冲液（9.0、10.0、11.0）配制底物。一个酶活单位（U）定义为：在上述条件下每分钟催化产生相当于1 μmol还原糖所需的酶量。
1.3.2 松二糖酶转化工艺
用pH 7.0缓冲液（50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4）配制浓度为2.5 mol/L的蔗糖母液，按反应体系10 mL加蔗糖母液8.0 mL和酶液，不足部分用缓冲液补齐。突变体分析时，按3.5 mg/mL加酶（通过粗蛋白含量和蛋白电泳灰度积分计算目的蛋白含量），缓冲液补齐到10 mL，温度30 ℃，pH 7.0，反应48 h。
双突变S271A/I382Q加酶量对酶转化的影响：蔗糖母液8 mL，酶液按20 U/mL、40 U/mL、60 U/mL、80 U/mL、100 U/mL分别加酶，加缓冲液补齐到10 mL，温度30 ℃，pH 7.0，反应48 h。
反应温度对酶转化的影响：蔗糖母液8 mL，酶液按60 U/mL加酶，选择不同反应温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃），加缓冲液补齐到10 mL，pH 7.0，反应48 h。
反应pH对酶转化的影响：用不同pH的K2HPO4-KH2PO4缓冲液（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）和不同pH的Na2CO3-NaHCO3缓冲液（9.0、10.0、11.0）配制蔗糖母液，蔗糖母液8 mL，酶液按60 U/mL加酶，加相应pH缓冲液补齐到10 mL，温度30 ℃，反应48 h。
蔗糖浓度对酶转化的影响：用pH 5.0缓冲液（50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4）配制浓度为2.75 mol/L的蔗糖母液，按反应体系10 mL加蔗糖母液（控制终浓度1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）和酶液，加缓冲液补齐到10 mL，温度30 ℃，反应48 h。酶反应结束后，在沸水中煮沸10 min灭活，用HPLC检测松二糖生成量。
1.3.2 HPLC分析检测产物
将酶转化反应产物以12000 r/min离心10 min后取上清，用水稀释至适当倍数后与乙腈按照1∶1的比例进行混合，在4 ℃冰箱放置8 h后离心取上清，用0.22 μm的滤头进行过滤。采用HPLC进行检测分析，检测条件为：Agilent 1200 HPLC色谱仪，示差折光检测器（RID），色谱柱为Syncronis Amino Column 4.6 mm × 250 mm （5 μm），流动相为80%乙腈（体积分数）和水的混合液，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃。松二糖产率公式：
1.4 分子动力学模拟
首先利用SWISS-MODEL网站对S271A和S271A/I382Q突变体的结构进行同源建模。利用GaussianView软件生成配体松二糖或海藻酮糖结构，并进行QM/MM优化，计算获得配体电荷。然后利用LeDock软件按照分子对接的标准流程进行分子对接。最后获得S271A和S271A/I382Q与松二糖复合物。使用PROPKA3方法对可解离残基（Asp、Glu和His）的质子化状态进行分配。基于上一步获得的复合物结构，进行分子动力学模拟。采用Amber ff14SB和GLYCAM_06j力场来分别描述蛋白和碳水化合物。首先将复合物结构沉浸在TIP3P水盒子里，且水盒子边缘距离蛋白表面的最小距离是1.6 nm。然后加入适量的钠离子以平衡系统电荷。体系先在NVT系综缓慢升温到300 K，接着在NPT系综平衡2 ns从而使体系的压力密度稳定，最后进行50 ns MD模拟。所有MD模拟均通过Amber 18 GPU 版本进行。积分步长为2 fs， 用SHAKE算法来约束所有的共价键。长程静电相互作用通过Particle Mesh Ewald（PME）计算，非键相互作用的截断半径为1.2 nm。轨迹分析通过VMD和AmberTools19的标准模块进行。
3D结构可视化图片的制作软件选用PyMOL软件，数据分析图片选用Origin软件。
2 结果与分析
2.1 突变位点的选择与设计
以与S271A序列一致性为41.21%的Xanthomonas axonopodis蔗糖水解酶（XaSH）为模板（PDB编号为3CZK），采用SWISS-MODEL对S271A进行同源建模[图2(a)]，QMEAN和GMQE打分结果分别为-2.38（高于−4）和0.76（接近1），表明模拟结构可靠。通过LeDock程序将松二糖对接到S271A的活性口袋，对其果糖结合区域的位点进行分析[图2(b)]。同时与同家族淀粉蔗糖酶进行多重序列比对[图2(c)]。蛋白结构3CZK确定了XaSH的−1和+1亚位点，同时蛋白结构1MW0确定了NpAS的−1、+1、+2、…、+5位点。其中，−1亚位点是底物蔗糖结合时葡萄糖单元的结合位点，也是聚合反应时底物糖单元延长的位点；+1亚位点是底物蔗糖结合时果糖单元的结合位点，也是聚合反应时葡萄糖的结合位点；+2、…、+5亚位点是聚合反应时麦芽寡糖的结合位点。通过分析对比，可确定CcSH S271A的−1、+1、+2等亚位点，在CcSH S271A中处于+1亚位点但不保守的氨基酸为I209、V211、P273和I382。为了探究S271A与淀粉蔗糖酶的位点差异对松二糖合成的影响，将I209、V211、P273和I382分别突变成淀粉蔗糖酶中对应氨基酸，即设计突变体I209R、V211I、P273A和I382G，同时为了在P273位点引入可能的氢键设计突变体P273S。此外，在所有淀粉蔗糖酶和蔗糖水解酶中，除了在382位点处为I外，其他酶在该位点处均为无侧链的G，这可为+2亚位点糖单元的结合提供空间以利于生成高聚合度麦芽寡糖或直链淀粉（PDB 编号1MW0）。I382形成的空间位阻破坏了+2亚位点糖的结合，这也是具有转苷活性的S271A不产生高聚合度产物的可能原因。针对这一特征，设计突变体I382S、I382T、I382Q、I382K和I382R，以在保留空间位阻的同时，引入不同链长的极性氨基酸，可能为+1亚位点果糖单元的结合提供氢键相互作用。
图2 结构模拟与序列比对分析
2.2 突变体的构建与重组表达
以质粒pET-24a(+)-ccsh S271A为模板，通过PCR获得上述10个突变体基因，并在E. coli BL21（DE3）中重组表达。取样测发酵液菌浓OD600，同时离心收集1 mL菌体，破壁后取上清测定酶活，结果如图3所示，所有表达突变体的菌株，除S271A/I382R、S271A/V211I表达宿主菌浓明显高于S271A外，其余差别不大。所有突变体发酵液酶活均出现不同程度的下降，其中S271A/I382G、S271A/I382T和S271A/I382Q酶活分别为11.9 U/mL、11.8 U/mL、11.2 U/mL，为单突变体S271A酶活的80%以上；而其他突变体发酵酶活受到较大影响，特别是S271A/I382K、S271A/I382R、S271A/P273S和S271A/I209R的酶活下降至单突变体S271A的20%以下。
图3 突变体摇瓶发酵情况
2.3 突变体制备松二糖性能表征
制备松二糖时，以2 mol/L蔗糖为底物，按目的酶量3.5 mg/mL加量加入S271A和各突变体，在pH 7.0、30 ℃条件下反应48 h。结果如图4所示，仅突变体S271A/I382Q制备松二糖的产率提高，达到60.2%，松二糖的浓度为408.7 g/L。同时，副产物海藻酮糖的产率比S271A（9.1%）显著降低，仅为2.3%，此时海藻酮糖和松二糖比例为0.04（2.3%/60.2%），显著低于S271A的0.16（9.1%/55.9%）及N. polysaccharea 淀粉蔗糖酶的0.12（或0.21），有利于松二糖后续分离及纯化。因此，选择突变体S271A/I382Q进行后续研究。
图4 突变体制备松二糖的HPLC结果分析
2.4 突变体S271A/I382Q的纯化
为了考察双突变体S271A/I382Q的酶学性质以及工业化应用潜力，同时与单突变体S271A酶学性质进行对比，本研究对S271A/I382Q进行了纯化，经镍柱亲和色谱，达到获得电泳纯（图5），比活为11.5 U/mg（表2），与S271A比活（13.1 U/mg）较为接近。
图5 纯化后突变体S271A/I382Q的SDS-PAGE分析
M—低分子量蛋白Marker；1—S271A/I382Q
表2 S271A/I382Q纯化过程参数
2.5 突变体S271A/I382Q的酶学性质
以蔗糖为底物测得S271A/I382Q的Km为1.5 mmol/L，比S271A的Km（4.2 mmol/L）显著降低，说明S271A/I382Q与底物蔗糖的亲和力更好。kcat为14.8 s−1，较单突变体略有降低。kcat/Km为9.8 mmol/(L·s)，是S271A的1.96倍，催化效率显著提高。
为了探究S271A/I382Q的最适反应温度，在20~50 ℃的条件下测定酶活。如图6(a)所示，S271A/I382Q的酶活随着温度的升高而先上升再下降，最适温度为45 ℃，和S271A相同。将其置于30 ℃，每隔24 h定时取样测定残留酶活。结果显示，S271A/I382Q的半衰期为384 h[图6(b)]，比S271A的半衰期长72 h，说明将S271A第382位点突变为谷氨酰胺会提高酶的热稳定性，更有利于工业化应用，S271A/I382Q稳定性的增加，可能是游离酶或382Q不与受体位点果糖形成氢键时，382Q的侧链与邻近催化三联体的D380形成氢键（图7），有利于稳定酶的结构。
图6 突变体S271A/I382Q的酶学性质
图7 突变体271A/I382Q中Q382和D380的氢键相互作用
为了探究S271A/I382Q的最适pH，在pH 5.0~11.0条件下测定酶活。如图6(c)所示，S271A/I382Q的最适pH为8.0，pH在6.5~8.5的范围内，相对酶活均在85%以上，超过该pH范围时，酶活骤降，但在pH 6.5以下，较S271A下降缓慢。为了探究S271A/I382Q在不同pH下的稳定性，将上述酶液在pH 5.0~9.0、30 ℃保温48 h后测定酶活。结果表明，S271A/I382Q在pH 6.0~7.0范围内较稳定，相对酶活均在90%以上，最稳定pH为6.0，低于S271A的最稳定pH 8.0，而在偏碱或偏酸的条件下稳定性较差[图6(d)]。
2.6 突变体S271A/I382Q制备松二糖条件优化
为了进一步提高双突变体S271A/I382Q制备松二糖的产率以及探究酶转化条件优化对产物中松二糖纯度的影响，将酶转化条件中的加酶量、反应温度、初始pH和蔗糖浓度进行优化。首先以2.0 mol/L蔗糖溶液为底物，在pH 7.0和30 ℃条件下，反应48 h，考察了不同加酶量（20~100 U/mL）对松二糖制备的影响。结果如图8(a)所示，当S271A/I382Q的加酶量由20 U/mL增加到为40 U/mL时，松二糖的产率从53.1%升高到57.4%，继续增加酶量，松二糖产率逐渐下降，表明过多的酶液并不利于松二糖的制备，最适加酶量为40 U/mL。
图8 S271A/I382Q催化制备松二糖的条件优化
为了探究S271A/I382Q制备松二糖时的最优温度，本研究以2.0 mol/L蔗糖溶液为底物，加入40 U/mL的S271A/I382Q，在pH 7.0、20~50 ℃条件下进行酶促反应，反应时间为48 h。松二糖产率如图8(b)所示，当温度为30 ℃时，松二糖的产率达到最高，为57.4%，与S271A制备松二糖的最适温度一致。
在上述加酶量和温度优化的基础上，对反应pH进行优化。以2.0 mol/L蔗糖溶液为底物，考察pH 3.0~10.0对松二糖制备的影响。结果如图8(c)所示，pH 5.0~8.0有利于松二糖制备，其中当pH为5.0时，松二糖产率最高，达到70.3%；当pH低于5.0或高于8.0时松二糖产率显著下降至32%以下。和S271A制备松二糖相比，最适pH由8.0降为5.0，可能由于在催化三联体附近引入了极性氨基酸并与之形成氢键（图7），改变了催化三联体氨基酸的解离平衡。
本研究还优化了S271A/I382Q制备松二糖的底物浓度，以1.0~2.5 mol/L的蔗糖溶液为底物，S271A/I382Q的加量按照底物浓度设定为20~50 U/mL，并在30 ℃、pH 5.0的条件下催化反应48 h。结果如图8(d)所示，当底物浓度为2.0 mol/L时，松二糖产率达到最高，为70.3%，此时产物中松二糖的浓度为480 g/L。
通过上述S271A/I382Q制备松二糖的工艺优化，确定了最适的酶转化条件。在pH 5.0、温度30 ℃的条件下，以2 mol/L的蔗糖溶液为底物，添加40 U/mL的S271A/I382Q，反应48 h，松二糖的产率最高（为70.3%），此时产物中松二糖的浓度为480 g/L，在此条件下制备的产物中未检测出海藻酮糖。该产率高于现有文献报道N. polysaccharea 淀粉蔗糖酶（56%）、N. polysaccharea 淀粉蔗糖酶突变体G396S（61.7%），以及C. crescentus 蔗糖水解酶突变体S271A（66.3%）的松二糖产率，同时也高于添加果糖进行转化时的N. polysaccharea 淀粉蔗糖酶（61.6%）及其突变体G396S（67.6%）的松二糖产率（松二糖对总底物产率）。更为重要的是，S271A/I382Q经过工艺条件优化，不产副产物海藻酮糖。
2.7 分子动力学模拟分析
从上述酶转化研究可以看出，S271A/I382Q相对于单突变体S271A不仅提高了松二糖（α-1，3键）的产率，而且极大降低了副产物海藻酮糖（α-1，1键）的生成量（图4），表明S271A/I382Q更倾向于催化α-1,3键合成。S271A/I382Q更倾向于催化α-1,3键合成，原因可能是对于不同突变体而言，果糖在参与形成糖苷键时的构象的偏好性不同。为了验证该猜测，分别对S271A和S271A/I382Q与松二糖和海藻酮糖进行了分子对接，并在对接的基础上进行了50 ns的MD模拟以检测果糖在受体位点的相互作用情况。蛋白骨架的RMSD值随时间演变的结果如图9(a)、(b)所示，体系均在10 ns后达到平衡。随后对MD模拟的轨迹进行了分析（图10）。
图9 CcSH突变体蛋白骨架原子的均方根偏差 （RMSD） 随时间演变过程
在单突变体S271A中，当果糖3号位羟基靠近葡萄糖形成α-1,3糖苷键（松二糖）时，I382与I314构成的疏水簇与糖环中心的平均距离为0.51 nm [图10(a)蓝色散点。注：距离越近，疏水作用越强，平均距离以最近距离氨基酸为准，此处不考虑I382，见图10(b)]，因此能够通过疏水堆积稳定果糖在+1亚位点的结合[图11(a)]；当果糖以1号位羟基靠近葡萄糖形成α-1,1糖苷键（海藻酮糖）时，由于果糖1号位羟基定位的限制，果糖基偏离+1亚位点，疏水簇与糖环中心的平均距离为0.57 nm[图10(a)橙色散点、图11(b)]，疏水簇的堆积作用较弱，因此S271A生成松二糖的能力较强。
图10 CcSH突变体与松二糖/海藻酮糖相关距离随时间的演变过程
图11 CcSH突变体与松二糖/海藻酮糖复合物的相互作用分析
在双突变体S271A/I382Q中，当果糖以3号位羟基靠近葡萄糖形成α-1,3糖苷键（松二糖）时，仅I314能够提供疏水相互作用，并且I314与糖环中心的平均距离为0.61 nm [图10(c)蓝色散点、图11(c)]，远于S271A中的0.51 nm，疏水相互作用减弱，但是Q382可通过侧链氨基与果糖6号位羟基形成氢键（0.30 nm）[图10(d)紫色散点、图11(c)]，弥补疏水作用的减弱，最终也能稳定果糖在+1亚位点的结合。当果糖以1号位羟基靠近葡萄糖形成α-1,1糖苷键（海藻酮糖）时，同样由于果糖1号位羟基定位的限制，果糖基偏离+1亚位点，I314与糖环中心的平均距离为0.70 nm [图10(c)橙色散点]，远于S271A中的0.57 nm。同时，由于Q382不能和果糖的羟基形成氢键（0.56 nm）[图10(d)绿色散点、图11(d)]，导致果糖以该构象与酶结合的能力很差。因此，与S271A相比，S271A/I382Q具有生成松二糖的更大优势，而副产物海藻酮糖合成能力甚微。
综合上述分析，S271A/I382Q中I382Q的引入在保证松二糖果糖单元稳定结合的情况下，降低了对海藻酮糖果糖单元的结合，因此可以降低副产物海藻酮糖的生成，提高产物松二糖的特异性。
结 论
在蛋白结构模拟的基础上，通过对S271A活性中心理性分析，选取4个可能与副产物形成有关的位点进行突变，其中双突变体S271A/I382Q松二糖产量提高，副产物海藻酮糖显著降低。进一步优化了S271A/I382Q制备松二糖的工艺。结果表明，以2 mol/L的蔗糖为底物，加酶量为40 U/mL，在pH 5.0，30 ℃的条件下反应48 h时，松二糖产率最高为70.3%，浓度为480 g/L，为国内外报道的最高水平，并且无副产物海藻酮糖生成。此外，分子动力学模拟表明，与S271A相比，S271A/I382Q +1亚位点与果糖单元的疏水作用降低，但通过氢键相互作用能够稳定果糖参与形成α-1,3糖苷键时的构象，因此提升了生成松二糖的反应特异性。
通讯作者及团队介绍
吴敬(1969.05.19—)，女，江南大学教授，博导。江苏镇江人，中共党员，先后担任江南大学研究生院副院长、食品科学与国家重点实验室常务副主任。酶工程与技术领域著名学者，主持包括国家杰出青年基金、国家重点研发项目、国家自然科学基金重点项目等国家省部级及产学研项目30余项。作为第一完成人获国家技术发明二等奖、中国商业联合会科学技术特等奖、教育部高等学校科技进步一等奖。吴敬教授入选教育部国家级重大人才计划、国家高层次人才特殊支持计划、江苏省“333人才工程”第一层次、科技部中青年科技创新领军人才、教育部新世纪优秀人才支持计划等；获聘江苏省特聘教授；获全国三八红旗手、全国优秀科技工作者等称号。
吴敬教授于1986年、1992年在无锡轻工业学院分别获学士学位及硕士学位，师从中国工程院院士伦世仪教授。1993—2001年在中国药科大学任教，期间在中国药科大学获博士学位，后远赴美国密歇根大学从事博士后和助理研究员工作。于2006年回国，任职于江南大学，主要研究领域是酶制剂制备及应用。在新酶基因挖掘与鉴定方面，发明了新型快捷精准的酶基因挖掘新技术，破解酶制备源头性难题；在酶功能认知和分子改造方面，构建了高效酶结构解析及区域重构技术；在酶高效制备原理和技术革新方面，发明了快速合成与高效转运相协调的酶发酵新技术；在酶制剂加工应用方面，建立了多个高效工业化生物转化体系，扭转了我国生物制造技术不足的局面。相关研究成果已在国内外权威刊物上发表论文200余篇(SCI论文155篇)，出版专著和教材4本(英文专著1本)，授权国内发明专利132件，国际发明专利11件。如今，吴敬教授团队的研究成果已成功应用到20余家企业，取得了显著的经济和社会效益。
作为大学教师，吴敬教授忠于教育事业，始终牢记教书育人初心，践行着一名高等教育工作者的历史使命，在讲台上孜孜不倦的耕耘与学术上的求知探索相得益彰。主持江苏省研究生教改项目“培养创新思维的高级生物化学课程教学”，参与国家精品课程“微生物遗传育种”的建设，其独特的授课风格使空洞抽象的理论知识变得通俗易懂，在激发学生们投身科研兴趣的同时，更传递一种平和的处世心态和积极的人生态度，广受学生好评。组织本科生开展国家级和校级大学生创新训练计划项目，从实验基本操作规程到科研创新思路，事无巨细地耐心指导，使本科生学习能力和科研能力显著提升；指导本科生获得全国大学生生命科学创新创业大赛二等奖和全国大学生生命科学竞赛三等奖。采用“学研产”一体化人才培养模式，注重培养学生思维方式和科研能力，重视科研实践，将企业需求与基础研究有机结合，团队研究生实践能力和创新能力得到明显提高。目前已指导硕士、博士、博士后和留学生百余人，毕业生主要就职于中国科学院上海高等研究院、江南大学和贵州大学等高校和科研院所，以及华大基因、安捷伦和药明康德等行业龙头企业，为国家和社会发展做出了重要贡献。
团队简介
研究室由国家杰出青年基金获得者吴敬教授领衔，依托于江南大学食品科学与技术国家重点实验室和生物工程学院，运用分子酶学、酶工程、基因工程和发酵工程开发新型发酵产品及功能性食品。
自2008年建室以来，发表论文200余篇（SCI论文150余篇），授权发明专利100余项（其中11项国际发明专利）。主持国家重点研发计划重点专项项目、国家自然科学基金重点项目、国家杰出青年基金、973子课题、863课题、江苏省自然科学基金以及江苏省工业支撑等20多项国家省部级项目。迄今已开发出多种酶制剂和酶转化产品。本研究室现有教授3名，副教授1名，讲师1名，助理研究员3名，博士及硕士研究生50余名。
研究方向
1. 新型酶制剂的挖掘及基因鉴定(enzyme discovery and gene identification)
结合传统筛选、蛋白质化学和微生物代谢网络分析，寻找生物催化新途径及新酶，开发具有新功能和适应新过程的高效食品生物催化剂；利用生物信息学、基因组学以及蛋白质组学技术鉴定酶的编码基因。
2. 蛋白质分子设计与定向改造(molecular design and protein reconstruction)
利用生物信息学、构效关系分析、催化反应工程、高通量筛选技术等全面开拓催化剂的新功能，拓展可催化底物谱；通过探讨酶的构效关系及其催化规律本质、揭示酶催化发生的识别机制和分子动态过程，实现生物催化剂的定向改造。
3. 基因工程高效表达系统构建(construction of efficient expression system)
构建高效分泌型表达载体。针对所采用宿主菌胞外蛋白分泌途径的特点，强化蛋白胞内运输及跨膜转运，研究蛋白合成与分泌之间的协调偶联并建立分泌机制模型，实现蛋白胞外基质的高效表达。
4. 发酵过程优化与控制(fermentation process optimization and control)
以工业生物技术中具有代表性的微生物（细菌、放线菌、霉菌和酵母等）为研究对象，利用代谢工程、生化反应和传递动力学、生物反应器工程理论研究外界环境变化对生物发酵生理的影响及生物自身响应机制，从优化微生物自身基因型、调节胞内微环境和优化宏观环境这三方面，针对发酵过程中微生物表现出的特殊生理状态进行优化，建立适合培养特定微生物的最佳发酵策略。
5. 酶催化和生物转化技术(enzyme catalysis and biotransformation)
利用蛋白质工程技术获得适合工业化应用的食品酶制剂并改造其物质转化功能与提升转化效率。通过对催化剂本身、催化反应过程、催化剂的表达等方面的系统研究，从分子水平对催化反应的反应机理如路径、过渡态、产品分布等关键问题进行研究。
责任编辑：焦欣渝
排版设计：任晓静
总监制：胡晓丹
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