【直播课干货集锦】|| 不可不看的课后笔记：生物透射电镜样品精选10问之制备篇！！

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没有听到我们Li老师的电镜课程也没关系

看了这篇让你轻松获取样品制备秘籍📕

小A

透射电镜可以观察哪些生物样品？Li老师透射电镜可以观察生物样品的内部结构，负染色一般用于观察生物大分子（包括蛋白、脂质、核酸、病毒等）的大小、形貌。

小C

不同生物样品取样时注意事项？Li老师1. 组织类样品，取样必须快速，工具锋利，准确，大小一般为1-3mm³并且避免污染；

2. 细胞类样品，10⁶以上的细胞，用细胞刮刀刮下来（不要反复刮取，动作迅速一次性刮取下来），1500-3000转离心，5-10min，收集细胞于管底肉眼可见2-3粒大米体积大小的样品。

3. 微生物样品，液体培养基培养的微生物吸取OD0.5-0.8的培养物，离心后弃培养基，收集菌体沉淀于管底黄豆大小。 

小D

取材之后怎么固定？

Li老师

将样品放置1.5ml或2ml的离心管中，管中加满4℃预冷的2.5%的戊二醛

注意：特殊样品如植物组织类样品若出现不沉底的现象需要通过抽真空的方式使样品沉淀下去；若是标本的壁比较后可以通过调整固定液和固定程序来增强渗透能力。

酵母：收集好的菌体先在0.1M，pH7.4的磷酸缓冲液（其中含0.1-0.5mol/l半胱氨酸）中浸洗15-30m，然后用6%戊二醛（缓冲液同前）固定2h以上。

真菌孢子：15%甲醛（0.1M，pH7.4的磷酸缓冲液）中处理2h，缓冲液漂洗后，6%戊二醛（缓冲液同前）固定2h以上。或者，用4%戊二醛（含0.01mol/l CaCl2和3%Triton X100，用0.1M，pH7.4磷酸缓冲液）固定2-4h，用缓冲液漂洗后，再用上述固定液（不含Triton和CaCl2）固定过夜。

细菌：3%戊二醛（含0.01% CaCl‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍2‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍ · 2H2O，用0.1M，pH7.4的磷酸缓冲液）固定。

小E

固定液怎么配置？ 

Li老师

戊二醛固定液配方：

配制2.5%的戊二醛水溶液：

25%戊二醛水溶液                      10ml

0.2M磷酸盐缓冲液（pH7.0）        50ml

蒸馏水加至                               100ml

缓冲液的配制方法：

A液：Na2HPO4·H2O 31.61g，或者Na2HPO4·7H2O 53.63g，或者Na2HPO4·12H2O 71.64g，加蒸馏水至1000ml

B液：NaH2PO4·H2O 27.6g，或者NaH2PO4·2H2O 31.21g，加蒸馏水至1000ml

0.2M，pH7.0磷酸缓冲液：A液61ml，B液39ml。

合起来是100ml，磷酸缓冲液终浓度是0.1M。

小F

固定好之后怎么邮寄？

Li老师

标本按照要求切小，放置在1.5ml或者2ml的eppendorf管中。切不可直接把切得大块的标本放在超过2ml的管子里邮寄过来。管子里需要装满固定液并用封口膜包扎，防止运输过程中，因为颠簸而使标本块离开了固定液，也防止液体漏出。管子上以及送样单上清楚标注标本名称，可以简化一点，但不要只是简单采用数字或字母。

注意：一定不能因为想保护标本而采取过度低温措施（比如放置过多的冰袋），导致标本结冰，这会直接失去做电镜的意义，冬天气温低于零摄氏度的地区样品寄送需要做好防冻措施。

小U

透射电镜前处理过程及周期？

Li老师

第一步：固定----样品中加入4℃预冷的2.5%的戊二醛，固定4h以上

第二步：冲洗----用PBS缓冲液进行漂洗1-2h

第三步：固定----样品中加入1%的饿酸固定1h

第四步：冲洗----用PBS缓冲液进行漂洗1-2h

第五步：脱水----将样品按照浓度梯度依次放入50%、70%、80%、90%、95%的乙醇或丙酮中浸泡15min，然后用无水乙醇或无水丙酮中浸泡30min脱水两次

第六步：包埋----先用100%丙酮：包埋剂=1:1处理1h，然后100%丙酮：包埋剂=1:3处理3h，最后用纯包埋剂过夜包埋

第七步：聚合----用恒温聚合仪70℃过夜聚合

第八步：切片----超薄切片，切片厚度为50-100nm

第九步：染色----醋酸铀----柠檬酸铅双重染色各15-30min

一般样品制备是每周固定时间统一处理，老师需要耗费2-3天的时间才能做出完美的切片。

小M

含水率高的样品戊二醛是不是很难进去？

Li老师含水率高的样品相较于含水率低的样品戊二醛更容易进入和替换。

小K

为什么负染之后细菌全是黑的

Li老师负染主要用于观察小的颗粒物质，细菌负染后会有着色，因为样品本身有厚度，所以电子束不能穿透，细菌的负染色主要用于观察鞭毛、菌毛结构，如需观察内部结构建议进行超薄切片。

小Q

细胞可以用胰酶消化吗？

Li老师

可以用胰酶消化，但是如果观察细胞间的连接不能用胰酶消化，需要用细胞刮刀。

小S

做好的包埋块和切片可以放置多久呢？

Li老师

包埋块和切片都可以稳定的长期保存。

要是有菌菌没有回答到的，还有提问的机会哦！🙋‍
今晚（周四）19：30🌼咱们b站直播间不见不散🌹 由Li老师来一一解答~👩【直播链接】    http://live.bilibili.com/21727250    （复制链接打开观看即可）

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