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技术突破!叮~全新免疫荧光实验操作指南,请查收
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免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。传统实验方法用小玻片,先泡酸、再晾干、再 coating、再种细胞、染色、封片成像。
本文介绍新方法,我们将描述在通道载玻片内培养大鼠成纤维细胞(Rat1)的单个实验案例。然后,我们用AlexaFluor®488鬼笔环肽染色F-肌动蛋白细胞骨架,并用DAPI对细胞核进行复染。
该实验包括四个主要步骤:
培养,固定,染色,成像。
在无菌条件下打开μ-Slide I ibiTreat(80106)并将其放在μ-Slide架(80003)上。将100μl 3×105细胞/ ml Rat1细胞悬浮液加入通道中。如下图所示直接加入通道。
用提供的盖子轻轻地盖住储液器。不要完全关闭它们。 将架子放入培养箱(37°C; 5%CO2)中,让细胞附着(60分钟)。然后用0.5ml无细胞培养基填充两个储库。 培养过夜。
通过使用细胞培养抽吸装置或移液管从储库中吸出整个培养基。用Dulbecco's PBS洗涤细胞,缓慢地将1ml液体施加到一个空的储液器中,并从对面的储液器中吸出。
通过在PBS中使用200μl的3.7%多聚甲醛以相同的方法固定细胞。从通道的另一侧移除储液器的液体并等待10分钟。
如步骤5中所述,用1ml PBS再次洗涤细胞。 在PBS中使用200μl0.1%Triton®X-100溶液通透3-5分钟。 在PBS溶液中施加200μl的1%BSA 溶液封闭20分钟。 用PBS洗涤细胞。
从通道中清除所有液体。从通道中吸出液体后,不要让通道干燥。 用100μlAlexaFluor®488鬼笔环肽(1Unit+500μl PBS+ 1%BSA,InvitrogenCorp.)在室温下培养20分钟。 用PBS洗涤细胞并清空通道。 施用100μlDAPI(0.1μg/ ml,Sigma-Aldrich)3-5分钟。 用PBS洗涤细胞并除去所有液体。用滴管瓶注入100μl Ibidi安装介质。用提供的盖子盖住储液器。μ-Slide可以存储大约4周。 在荧光显微镜下选择适当的滤镜,也可以使用浸油观察细胞。
End
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