​【实验】Elisa技巧总结

1抗原和抗体最佳工作浓度的确定

抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。
　　方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为0．8左右，阴性参考血清A值<0．1的包被抗原稀释度为工作浓度。
　　方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度 将抗体用包被液稀释为10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l 000、l:5000、l:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值<0.1的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。

2抗体的稀释度及稀释液的测定方法

抗体的稀释度包括特异性抗体，中间抗体及标记抗体。任何一种免疫组化方法要想得到令人满意的染色效果，必须将抗体进行最佳稀释。一般来说，抗体的稀释度取决于下列因素。

(一)抗体的浓度(亦称滴度)

每毫升溶液内所含抗体分子越多，滴度就越高，该抗体可高度稀释，尤其是特异性一抗的稀释度。一般商品化抗体只知道每毫升含多少抗体蛋白量，不知道所含抗体分子。自己制备抗体可通过琼脂糖双扩散或放射免疫法进行测定。商品化抗体一般告知大约的稀释度，例如用PAP法可1：100～1：200稀释。但往往购买到一种新抗体后，需要利用组织切片进行最佳稀释度的测定。

(二)稀释度的测定方法

在测定抗体最佳稀释度时，可将阳性强度与背景染色以“+”形式来表达，“+ + + +”为极强阳性，“+ + +”为强阳性，“+ +”为弱强阳性，“+”为弱阳性，“一”为阴性。

1．直接测定法

按表2—4稀释抗体，4℃过夜，观察分析结果。从表2—4的结果中可知，400为最佳稀释度，因其特异性染色强，且背景低。

表2-4 抗体稀释度的直接测定法

一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性 一抗稀释度 特异性染色强度 非特异性

l：50 + + + + + + l：400 + + + (一)

1：100 + + + + + + 1：500 + + (一)

1：200 + + + + + 阴性对照 (一) (一)

1：300 + + +

2．棋盘稀释测定法

按表2—5稀释、测定，从表中显示的结果可知，一抗1：100、二抗1：200为最佳稀释度。

表2-5 抗体稀释度的棋盘稀释测定法

第二抗体 一抗稀释度

1 ：50 l：100 1：200 1：400

1：100 + + + +(+ +) + + + +(+ +) + + +(一) +(一)

1：200 + + + +(土) +++(一) + +(一) +(一)

1：400 + +(一) +(一) (一) (一)

注：括号内为背景染色

(三)抗体的配制

抗体的配制及使用是开展免疫组织化学工作的一个重要环节，其检测的结果既要可靠，又要能重复，这就要求实验人员在配制抗体过程中要注意其精确度。目前，随着抗体稀释液的稳定性提高，一次稀释抗体可用一年。当然，还可以购买到商品化即用型一抗，使用非常方便。

(四)抗体稀释液的种类

可根据需要选择不同的抗体稀释液。如稀释当天用完的一抗，用0．05m01／L(pH7.6)TBS即可。如需长期保存，可用如下稀释液：取0．1g明胶(或绿色明胶)溶在100ml0.05m01／L(pH7．6)TBS缓冲液中，边搅拌边加热至60℃，待完全溶解后，冷却至室温，加入1g牛血清白蛋白，最后加入200mg aN3，分装保存在一40℃中备用。另外，抗体原液应分装后一40℃保存，可保存5年以上。

3二抗浓度确定

1. 目前看到有关ELISA棋盘法确定抗原抗体浓度,都是间接法和双抗体夹心法.我现在做的是直接法.实验过程是这样的:我先用提取到的蛋白(抗羊IgG)直接包被在板上,用BSA封闭,然后用羊IgG作一抗,最后用驴抗羊IgG-HRP作酶标.我买的酶标物说明ELISA的范围在1:200~1:4000,我现在不知该如何确定羊IgG和驴抗羊IgG-HRP的最佳浓度.我做了一个实验,羊IgG的浓度分别为2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.125mg/ml,驴抗羊IgG-HRP为1:250,1:500,1:1000,1:2000,1:4000.用空白调零,得到的OD值显示出随羊IgG浓度下降而下降,也随驴抗羊IgG-HRP的稀释而下降.最高值达0.6,但我就是不知如何确定哪一组为最佳浓度.

2.我也做了这方面的内容，我认为你没必要用棋盘法来确定．因为直接法ＥＬＩＳＡ不用确定一抗的浓度，你直接将１００ng/ml的羊IgG进行包被，洗涤，用ＢＳＡ封闭，然后用你所说的驴抗羊IgG-HRP为1:250,1:500,1:1000,1:2000,1:4000分别加入，每个浓度加两个孔，每孔１００ul,最后显色，作曲线图，在图上找到Ａ值为１．０对应的驴抗羊IgG-HRP的浓度即可．

@抗原包被量一般是1-10微克每孔，从你的包被量上看，应该是足够的了，从你的OD值来看，有上升的趋势，但是OD值太小，我估计有三方面的原因：
1.血清抗体效价太低
2.二抗是否有问题
3.包被的效果不好（可能是你的抗原不纯，含有其他的无关蛋白同抗原相竞争包被在酶标板上）
至于最佳的浓度的标准是要以OD值接近１为准的！

￥抗原的包被浓度和抗体稀释都没有太大的问题，如果OD在0.02-0.09之间的话，应该说你的实验是失败的。同意楼上已总结了三个原因，你可依次排除：
1、二抗的问题，可直接按说明书提供的稀释方法稀释二抗后包被酶标板，显色看看OD值高低，至少2.0以上（490nm）；
2、抗体效价，可用标准血清做下对照，看看显色如何？
3、抗原纯度应在使用前鉴定，另外包被与蛋白的等电点相关，一般包被液的pH应高于蛋白的等电点。

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