10.32分的Biomaterials教你这样设计骨种植体来增加BMSC的粘附和分化

原文标题：

Decoupling the effects of nanopore size and surface roughness on the

attachment, spreading and differentiation of bone marrow-derived stem

cells

中文翻译：

解耦纳米孔大小和表面粗糙度

对骨髓干细胞附着、扩散和分化的影响

原文作者：

Jing Xia, et al.

期刊来源：Biomaterials

影响因子：IF=10.32

01

背景介绍

骨髓源性间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)具有分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种细胞类型的能力。其中成骨细胞一直被认为是治疗骨质疏松症等骨疾病或通过人工种植体周围生长新骨来修复骨组织的潜在细胞基质。可以通过在纳米尺度上设计骨种植体的二维表面形貌，可以促进种植体周围的骨髓间充质干细胞的生长，从而促进骨愈合。

表征纳米孔表面形貌的参数有很多，其中纳米孔尺寸和表面粗糙度是最基本的两个参数。这两个参数都可以显著影响骨髓间充质干细胞的粘附、扩散和分化等行为，这些都是细胞生存和功能的关键。然而，目前研究的一个重大局限性是，由于材料制造过程，这两个因素往往耦合在一起，这使得每个因素在多大程度上影响了BMSC的行为不清楚。

02

全文速览

本文的目的是区分纳米孔大小和粗糙度对骨髓间质干细胞行为的影响。研究人员利用纳米孔大小和粗糙度不同的二维纳米孔膜培养骨髓源性间充质干细胞(BMSCs)，并研究其附着、扩散和分化等行为。结果发现，增加纳米孔表面粗糙度对细胞附着没有明显影响，只是轻微降低细胞扩散面积，抑制成骨细胞分化。然而，在纳米孔较大的膜上培养的骨髓间充质干细胞附着细胞明显较少，扩散面积较大。此外,大的纳米孔会增强成骨细胞的分化，刺激表达更多的碱性磷酸酶、骨钙素、骨调素、胶原蛋白。这些结果表明,尽管纳米孔大小和粗糙度都可以影响BMSC,但纳米孔的尺寸比粗糙度在控制BMSC方面起到更重要的作用。

03

研究过程及结果

纳米孔膜的表征及细胞培养装置的制作

以纳米孔聚碳酸酯膜为模型系统，研究了纳米孔大小和表面粗糙度对膜间充质干细胞行为的影响。研究选择了不同纳米孔大小(10nm、80nm、200nm)的纳米孔膜来模拟皮质骨的纳米孔大小。结果显示，不同的膜具有相似的纳米孔密度（图1a），约为4×10⁸孔/cm²，这可以确保每个细胞遇到相同数量的纳米孔。此外，膜的开放面积低于11%，表明大多数细胞体是由固体表面支撑的，但仍然与表面的微小纳米孔相互作用。AFM对两面的形貌进行表征结果表明，其中一个表面的粗糙度比另一个表面高一个数量级（图1b和图1c）。XPS对两种膜的化学成分分析结果显示，膜的化学成分没有差异（图1d）。

图1

细胞培养

将膜夹在两层间隔层之间培养细胞，以便于培养基可以从四面八方到达细胞。简化的工作流程如图2a所示。16 h后，用扫描电镜的图像显示，细胞完全分散，能够跨越细胞膜上的数千个纳米孔，这表明细胞膜具有生物相容性，且在具有80nm孔径的粗糙和光滑膜上培养的骨髓间充质干细胞（图2b和2c）。

图2

BMSC在膜上的初始粘附数

为了研究纳米孔大小和表面粗糙度对骨髓间充质干细胞初始细胞粘附的影响，我们在接种后16 h对细胞数量进行荧光成像计数（图3a）。研究结果显示，纳米孔越大的多孔膜附着的细胞就越少（图3b）。同时，随着纳米孔从10 nm增大到200 nm，可用于细胞附着的固体表面积从99.97%减小到89.09%，这也可能是导致细胞附着减少的原因之一。与以往的报道称光滑的表面可以促进更好的粘附相比，本研究没有发现表面粗糙度对细胞初始粘附数量有显著影响（图3b）。

图3

BMSC扩散行为与黏附焦点尺寸量化

光滑膜上的三维细胞形状的俯视图和侧视图如图4a所示。结果表明，在200 nm孔径下，骨髓间充质干细胞的扩张面积几乎是在10 nm孔径下的2倍。相比之下，表面更光滑时，扩散面积仅增加20%左右（图4b）。同样地，200 nm孔上的骨髓间充质干细胞体积几乎是10 nm孔上的2倍，表面光滑，细胞体积增加了25%（图4c）。

图4

简化的细胞粘附结构示意图如图5a所示。研究结果表明，当粗糙度保持不变时，不同纳米孔尺寸的膜上的细胞呈现出不同的细胞结构，且粘附形状和方向不同（图5b）。有趣的是，平均局灶粘连大小随着纳米孔的大小而增大（图5c）。这些结果表明纳米孔的尺寸和表面粗糙度在调节粘着斑形态和大小都扮演了一个重要的角色。

图5

研究还发现：在成骨分化过程中，纳米孔尺寸的增大可能会刺激位于细胞质膜外的碱性磷酸酶(ALP) 的表达（图6b）。同时，I型胶原蛋白的分泌量在测试的纳米孔范围内增加了近2倍（图6d）。此外，骨钙素（OCN）和骨调素（OPN）增加1.4倍（图6f和图6h）。这表明,纳米孔的大小对BMSC成骨细胞的分化有显著影响，而粗糙度只有轻微的影响。

图6

04

总 结

本研究使用纳米孔聚碳酸酯膜来研究纳米孔大小和粗糙度对骨髓间充质干细胞粘附、扩散和分化的影响。结果证明，纳米孔变大会抑制骨髓间充质干细胞的初始粘附数量，但促进更大的扩散面积和细胞体积。此外，研究发现在较大孔径尺寸的纳米孔膜上有更多的成骨分化，且ALP、I型胶原蛋白、骨钙素和骨调素的表达水平更高。纳米孔的大小和表面粗糙度都可以调节细胞的扩散和分化行为，但程度不同;与表面粗糙度相比，纳米孔的大小对骨髓间充质干细胞的行为影响更为显著。然而，连接这些行为的生物学机制尚不清楚，值得进一步研究。

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