【1分钟学实验】WB干货之如何选择我的内参？

在众多的生物实验技术中，Western Blot在研究蛋白相关的实验中依然占据着重要地位，虽然实验不难，但因其周期较长，步骤较繁琐，影响因素较多，因此常常会遇到各种疑难杂症。

对于那些实验中出现的问题，我们要做到追本溯源，一步步查找原因，解决问题。今天我们就先讲一讲WB中内参的使用和选择。

1、 什么是内参

对于初始接触Western blot的童鞋最先要解决的便是内参的问题，内参既是内部参照，一般是指由管家基因编码表达的蛋白质(Housekeeping Proteins)，在组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白表达水平变化时常用它来做参照。

2、选择内参的依据

（1） 种属来源：根据所做的蛋白样本的种属确定，哺乳动物一般β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等；植物样本一般选择Plant actin、Rubisco等；其他来源样本应参考文献报道选怎合适蛋白作为内参。

（2） 蛋白表达位置：由于研究目的不同，对于细胞中不同部位蛋白的研究也要相应考虑不同的内参。一般总蛋白用β-actin、GAPDH作为内参即可，而针对细胞浆，细胞核，细胞膜等不同细胞定位的蛋白检测，最好使用相对应的内参，使得实验结果更具有科学性和严谨性。

（3） 目的蛋白分子量：一般应保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KDa以上，比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。

（4） 实验处理条件对内参表达的影响：实际的实验环境中，处理条件也许会改变一些内参的表达，这种情况下就要考虑研究的信号通路中是否会对内参有影响。如在糖代谢的研究中，不能用GAPDH作为内参，因为GAPDH是糖酵解过程中的酶，某些细胞中，缺氧也会改变GAPDH的表达。

3、内参的作用

内参蛋白在整个WB实验中可以说意义重大，作用非凡。首先，在WB结果中可以直观的判断目的蛋白的表达情况；若内参条带亮度一致，即可排除实验中上样量的影响；其次，由于内参蛋白容易显现，且存在范围广，能够帮助我们查找WB实验中的问题所在，如电泳，转膜条件是否合适，显色体系是否正常等。另外，在我们做WB之前，都会先根据内参调整上样量，这时可以少量上样如5μg左右，以节省蛋白样品。在做目的蛋白时，一般加30-50μg，若是清楚目的蛋白含量低或是比较难显现，可以相应加大上扬量，提高目的蛋白显现的几率。

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