生物小白的入门必修课——Western Blot之制胶

上回书说到，我们很轻松就制备出了质量上乘的蛋白质样本，现在就要开始跑蛋白了。

跑蛋白这事，就说来话长了，那我们就长话短说。

那么进入正文，我们对跑蛋白的介绍将从“制胶”、“跑胶”、“WB基本原理”、“WB常见的失误分析”等方面逐步介绍。

一、实验背景知识   

Western Blot，即蛋白质免疫印迹实验，常用于检测单克隆或多克隆抗体识别的特异抗原。其为分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

Western Blot常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，不同分子量的带负电荷的蛋白分子在电场中定向移动，分子量越低的蛋白质分子迁移速度越快，借此可区分不同分子量的蛋白。事实上，聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶孔径（由丙烯酰胺浓度决定）及蛋白质的电荷、分子量大小、形状等均决定了蛋白质的迁移率。

二、WB制胶 实验准备阶段

2.1 试剂耗材、药品等的准备

2个50ml烧杯（超声清洗并烘干）、1.5ml离心管；Tris、SDS、丙烯酰胺（Acrylamide）、过硫酸铵（AP）、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸（Glycine）；制胶架、玻璃板、封口膜。

2.2 相关液体的配制：

• Tris-Cl/SDS（PH=8.8 100ml）：
  60ml水溶解18.2g Tris碱（1.5mol/L），再加入0.4g SDS, HCl调PH=8.8，搅拌1h或至少40min后，再调一次PH，定容100ml，过滤。
• Tris-Cl/SDS （PH=6.8 100ml）：
  40ml水中加入3.025gTris碱（0.25mol/L），加入0.2g SDS，HCl调PH=6.8，搅拌1h或至少40min后，再调一次PH，定容100ml，0.45um定容100ml，过滤。
• 30% 丙烯酰胺溶液：
  丙烯酰胺=30g，甲叉聚丙烯酰胺=0.8g，加水60ml溶解，100ml定容。配制后注意避光保存
• 10% 过硫酸铵溶液（AP）：
  取0.1g过硫酸铵，加入EP尖管，加入1ml水，混匀，室温放置，避光保存（放在抽屉中）。或者称多少配多少（X mg AP粉末，配成10X μl液体）。注意现用现配，避光保存。不需要配太多，每两块胶只需要75ul的AP溶液。

三、玻璃板的清洗

玻璃器皿的清洁程度对于制胶来说十分重要。因此，本段将着重强调清洗玻璃棒的一些细节。有些同学可能认为，玻璃板上的细小水渍对最终结果并不重要，对此小编不能苟同。基本功不强，连玻璃板都洗不干净的实验员，回到家里又怎么能洗的干净碗筷呢，洗不干净碗，挨了家里领导的骂，心情不好，回来实验室就不能保持十分的精神来对付实验，那实验结果当然也好不到哪去。

在洗玻璃板之前，我们要对玻璃板架子进行超声清洗，之后大量自来水冲洗，最后大量超纯水冲洗，确保玻璃板架子的干净。若架子不干净，在之后烘干玻璃板的时候，也会引入不必要的污渍。

洗玻璃板，我们通常用打有洗洁精的湿海绵反复擦拭，同时注意自我保护，避免捏碎玻璃板。能够捏紧玻璃板使其不在清洁中打滑，又能够不过度用力掰坏玻璃板，这种力度我们通常会形容为“捏着一只麻雀”，既要不能让它飞了，又不能把它捏死了。

反复擦洗玻璃板，去掉了先前一位洗碗基本功不佳的实验员在玻璃板上留下的干了的粘手的电泳液和残留凝胶之后，就可以用流动自来水冲洗玻璃板了。反复从一个方向冲洗玻璃板，直至完全冲去洗涤液。再之后，用流动的超纯水冲洗玻璃板，直至完全冲去残留的自来水。到此，我们有句高中化学常说的话来作为干净的标准，“既不聚成水滴，又不成股下流”。

玻璃板和架子都洗好了之后，就要烘干了。我们常用的烘干温度是60℃，事实上，所有跑蛋白的塑料制品，烘干温度都不应当超过60℃。心急吃不了热豆腐，不止一次的小编看到有些师弟师妹把架子直接就塞到八九十度的烘箱里了，出来之后架子都融化了。真是老板再有钱，也禁不住一些小朋友的败家。朋友们有兴趣可以查一下BIO-RAD的原厂架子多少钱，查了之后就可以开始感慨，好多看起来不起眼的没有技术含量的东西，原来这么贵啊。

四、组装制胶架.

玻璃板就位完全。

左右手对称按下固定玻璃的夹子。

玻璃板下缘均匀贴上封口膜，增强灌胶时的边缘封闭。（学口腔的朋友，这时候可以想想我们做全口活动义齿的时候强调的边缘封闭，之后也就知道为什么自己配胶的时候总是漏胶了。）

石蜡封口膜有个特性，在延展之后开始有少许的粘性，能够很好地与玻璃板贴合。干燥条件下，在稍微施加压力的时候，封口膜能够很好封闭住两块玻璃板的下缘，也弥补了一些陈旧玻璃板边缘的磕碰损伤导致的后期边缘密合不佳。

上架子。夹子稳定、贴合就位于制胶架。

至此，制胶架组装完成。

五、配胶

5.1 配10%分离胶（丙烯酰胺终浓度10%）

将制胶架放置于平坦的地方，一定要水平。注意，不水平的胶不能用，蛋白转移出来是斜的，敷抗体时不好裁剪。（每两块胶）向25ml烧杯中加水6.25ml，再加入30%的丙烯酰胺溶液5ml，再加入3.75ml的PH=8.8 Tris-Cl/SDS，再加入TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）10ul，最后加入AP 50ul。液体轻摇匀，倒胶。

若是配12%分离胶，则水5.25ml+丙烯酰胺6ml+tris 3.75ml+TEMED 10ul+AP 50ul。

分离胶与绿板下缘相平行，距离胶板上缘约1.5cm。用无水乙醇封胶（使之不产生气泡，并压实分离胶），用200ul枪快吸取，沿板上缘打两次（来回）。此处强调，因为丙烯酰胺是有毒药品，封胶的枪头请不要反复抽吸酒精，以免用丙烯酰胺污染酒精。之后这个酒精还有可能被你的同门拿去配成75%乙醇，拿去细胞间。请不要用一时的方便来交换他人的健康。所以，更换枪头，或提前分装WB专用的酒精。

烧杯剩余的胶用于放在桌上观察其凝固程度。胶凝固时间约30min左右（室温，或37度），计时，随时观察。胶凝固后，将乙醇倒出，三蒸水冲洗胶面（三遍），胶架侧放，低位放置滤纸，利用虹吸作用吸干。

5.2 配浓缩胶/积层胶（丙烯酰胺终浓度3.9%）

（每两块胶）向25ml烧杯中加水3.05ml，再加0.65ml 30%丙烯酰胺，加入1.25ml的PH=6.8 Tris-Cl/SDS缓冲液，加入TEMED5ul，加入10%AP 25ul。轻混匀，倒胶，倒满为止。

梳子提前用浓缩胶液体润湿，插梳子，对齐后动作干脆，注意不要产生气泡。凝固时间约30min（室温，或37度）。

浓缩胶凝固后，可放入盒中，加入1×电泳液，4度可保存1天。

至此，配胶结束。

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利益声明：

    本教程未涉及任何商业推广，所用试剂、耗材可根据各课题组需求酌情更换。

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