Science 子刊，同济大学附属东方医院高崚等发现诱导多能干细胞的新应用，其外泌体可改善心梗
The following article is from 丁香学术 Author 萤火虫
据《中国心血管病报告 2013》显示，我国总心血管病患者达 2.9 亿，心血管病死亡是居民总死亡原因的首位。数据显示，我国每年新发心梗约 60 万例，死亡比例在三成以上，中青年人猝死频发是近年来的新特征。
在猝死患者中，大部分都有冠心病或其他冠状动脉病变。让人忧心警惕的是，国内心肌梗死发病年龄明显提前，特别是在青年科学家英年早逝的新闻一次次的刺痛大家的心扉。
在这种大环境下，心肌梗死的应急处理和预后恢复的研究显得尤为重要，近来同济大学联合国际团队在心肌损伤的恢复上取得新的突破 ——
2020 年 9 月 16 日，美国阿拉巴马大学伯明翰分校张建一、中国同济大学附属东方医院高崚研究员团队合作，在 Science Translational medicine 上发表了，题为 Exosomes secreted by hiPSC-derived cardiac cells improve recovery from myocardial infarction in swine 的研究性论文，发现由 人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的心脏细胞外泌体，可改善猪心肌梗死的恢复，而不会增加心律失常并发症的发生率，为心肌损伤提供了无细胞治疗的新选择。
图片来源：Science Translational Medicine
研究背景
多种动物模型研究表明，hiPSC 可以生成心肌细胞（CMs），平滑肌细胞 (SMCs) 和内皮细胞 (ECs)，在心脏修复疗法上具有广阔前景。然而，这种技术在临床上还存在很多问题，如细胞驻留率和植入率低，肿瘤发生和室性心律不齐的潜在风险，与传统治疗剂相比，细胞产品也更难以存储和运输，所以其临床应用仍然受到限制。因此，人们开始寻找更好的心血管治疗方法，比如利用 hiPSC 和 hiPSC 衍生细胞的心脏保护和再生特性，同时又避免了细胞移植的复杂性。
本研究通过使用来自不同 hiPSC 衍生细胞类型（hiPSC-CM，hiPSC-EC 和 hiPSC-SMC）的外泌体进行大量体外测定，并实验构建心肌梗死模型后，用 hiPSC 衍生心脏细胞分泌的外泌体治疗，评估猪的心肌恢复效果。
研究内容
表征 hiPSC 衍生的心脏细胞及其外泌体
首先，研究者对得到的 hiPSC-心脏细胞进行表征。从人心脏成纤维细胞中重编程，获得hiPSC-心脏细胞，并分为 hiPSC-CM，hiPSC-EC 和 hiPSC-SMC。纯化一周后，检测细胞标志的表达。
随后，研究者分离出不同细胞或细胞组合的外泌体，进行表征。具体来说，就是从培养的 hiPSC-CM，hiPSC-EC 和 hiPSC-SMC 或包含三种细胞类型的共培养物（hiPSC-CMs：hiPSC-ECs：hiPSC-SMC，2：1：1 比例）中，分离出外泌体。纳米粒子追踪和透射电子显微镜分析表明，分离的外泌体直径约 98 nm，具有双层膜；蛋白质阵列检测，确定了外泌体特异性标记物的存在。
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hiPSC-心脏细胞外泌体增强血管生成活性并保护缺氧损伤
研究者体外检测了 hiPSC-心脏细胞外泌体的功能。分别处理 hiPSC- ECs，hiPSC-SMCs，hiPSC-CMs，或共培养混合物的外泌体后，与处理人真皮成纤维细胞（hdFB）的外泌体或 PBS 相比，从主动脉环萌芽的内皮微血管，培养的人脐静脉内皮细胞中的管形成，均显著增加。
此外，用 hiPSC-EC，hiPSC-SMC 和 hiPSC-心脏细胞混合物，不用 hiPSC-CM 或 hdFB 外泌体处理，在无血清低氧条件下，显著增加了钙瞬变幅度，减少了凋亡，增加 ATP 的含量，但在常氧条件无显著作用。hiPSC-心脏细胞外泌体逆转了低氧诱导的 AKT 磷酸化下降。因此，hiPSC-心脏细胞混合物产生的外泌体可以增强内皮细胞的血管生成活性，促进 hiPSC-CM 的增殖，并通过阻止细胞凋亡，维持细胞内钙稳态，改善能量代谢，来保护 hiPSC-CM 缺氧。
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hiPSC-心脏细胞外泌体改善的心脏功能，限制不良重塑
随后，研究者构建了猪心肌梗死模型，在体检测了 hiPSC-心脏细胞和 外泌体的心脏保护和再生效果，分成五组：
Sham：假手术组，除了不结扎，其余步骤与 MI 相同；
MI：心肌梗死组，冠状动脉左前降支结扎 60 分钟后再灌注；
MI + Cell：hiPSC-CCs 细胞混合处理组（一千万个 hiPSC-CM，五百万个 hiPSC-EC 和五百万个 hiPSC-SMC）；
MI + Fra：与来自 MI + Cell 组，相同剂量细胞的均质碎片组；
MI + Exo：从混合的 hiPSC-CCs 中分离的 7.5 mg 外泌体组（hiPSC-CMs: hiPSC-ECs: hiPSC-SMCs =2:1:1）;
治疗操作方法：将细胞，碎片或外泌体，直接注射到心肌缺血区域。
手术四周后，在对动物进行安乐死评估心肌肥大之前，通过磁共振成像（MRI）和血液动力学分析，评估心肌梗死或假手术后 4 周的心脏功能。测量梗死面积，左心室射血分数，梗死区和梗死边界区域的左室舒张末期容积，收缩期增厚分数，区域壁应力，以及左室与体重的比值。这些指标在 MI+ Cell，MI+ Fra 和 MI+ Exo 组几乎相等，但较 MI 组显著降低。MI + Cell 组和 MI + Exo 组中心肌细胞的横截面积也相同，并且显著低于 MI 组。
这些结果表明，将 hiPSC-心脏细胞，hiPSC-心脏细胞片段和 hiPSC-心脏细胞外泌体，递送到猪心脏的梗死区域时，它们的心脏功能，壁应力，梗死面积，心肌肥大都有所改善。
图片来源：Science Translational Medicine
hiPSC-心脏细胞外泌体可促进血管生成，增殖，细胞存活和迁移分子的表达
再接下来，研究者进行了免疫荧光分析。测量血管密度（表达 CD31 的结构），小动脉密度（表达 CD31 和 SMA 的结构），以及心脏边缘区中的增殖（表达 Ki67 的细胞和含有磷酸化组蛋白 3 的细胞）。这些指标在 MI + Cell 组与 MI +Exo 组动物相似，均显著大于 MI 组。此外，MI + Cell 组与 MI +Exo 组凋亡阳性细胞的下降几乎相同，在促进细胞迁移中起关键作用的 Con43 和 CXCR4 分子表达水平增加也相同。
这些结果表明，移植的 hiPSC-心脏细胞诱导旁分泌，从而促进血管和小动脉的生长，细胞迁移，增殖和存活，以及细胞内通讯，并且可以通过使用 hiPSC-心脏细胞外泌体来复制这些作用。
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猪心梗模型中，hiPSC-心脏细胞外泌体改善细胞能量代谢
在心脏中，肌酸激酶（CK）快速可逆地将磷酸肌酸和腺苷 5'- 二磷酸，转化为 ATP 和肌酸，提供心脏的主要储备能量。最后，研究者进行了 31P 磁共振波谱磁化饱和转移（MRS-MST）实验，以确定在 Sham，MI，MI + Cell 和 MI +Exo 组动物之间，心肌能量代谢的指标是否有所不同。MI 诱导或假手术第 4 周后，PCr/ATP 比和 FluxPCr→ATP 均下降，MI + Cell 和 MI+ Exo 组比 MI 组更大。
此外，蛋白质印迹分析表明，心脏边缘区，MI+ Cell 组和 MI+ Exo 组中线粒体 ATPase- β（mtATPase-β），线粒体 CK（CK-Mt）和心肌 CK（CK-M）的蛋白表达几乎相等，均比 MI 组心脏的相应区域更大，而边缘区的脑 CK（CK-B），三组的表达相似。分光光度法检测也得到了同样的结果。这些观察结果表明，hiPSC-CC 和 hiPSC-CC 外泌体均阻止或逆转了心肌梗死发生的部分心肌能量代谢变化。
图片来源：Science Translational Medicine
创新点及问题
该研究首次在猪心肌梗死模型中，证明 hiPSC-CC 外泌体的改善心肌梗死的显著效果。由于大多数移植细胞在给药后，存活时间不超过几天，所以还研究了均质化的细胞碎片，也与细胞治疗具有同样的效果。
在体内，hiPSC-心脏细胞，hiPSC-心脏细胞片段或 hiPSC-心脏细胞外泌体，用三种不同方式治疗的动物的左心室功能，梗死面积，壁应力，心脏肥大，细胞凋亡和血管生成明显改善。
在体外，hiPSC-心脏细胞产生的外泌体，在培养的内皮细胞和分离的主动脉环上，促进血管生成活性。通过减少细胞凋亡，维持细胞内钙稳态，增加细胞 ATP 含量，保护无血清低氧培养基对 hiPSC-CMs 的毒性作用。
因为细胞和外泌体是在开胸手术中给药的，该技术目前的问题，是不能重复给药。此外，在体内研究中选择的 hiPSC-心脏细胞外泌体剂量（7.5 mg），是根据之前的研究确定的，该剂量表明 hiPSC-心脏细胞衍生的外泌体，在大动物心肌损伤模型中，与 hiPSC-心脏细胞本身具有同样的益处。虽然结果表明这两种治疗方法具有可比性，但仍需进行其他研究，确定哪种方法可能对心肌梗死，心力衰竭或其他类型的心血管疾病患者最有益。
Gao, Ling, Lu Wang, Yuhua Wei, Prasanna Krishnamurthy, Gregory P. Walcott, Philippe Menasché, and Jianyi Zhang. Exosomes secreted by hiPSC-derived cardiac cells improve recovery from myocardial infarction in swine. Science Translational Medicine 12, no. 561 (2020)
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