重磅综述 | 深度解析肠道干细胞的衰老与再生

翻译 By 王雪宝 杨宽 张保虎 王敏

此为2019年10月14日巴克衰老研究所的Heinrich Jasper教授在Annual Review of Physiology上发表的一篇标题为“Intestinal Stem Cell Aging: Origins and Interventions”的综述，文章详细介绍了与年龄相关的肠道再生能力衰退模型及其分子机制。

通讯作者：Heinrich Jasper教授（图片源于网络）

摘 要

维持胃肠道（gastrointestinal, GI）上皮细胞的再生功能对多细胞生物的健康和生存至关重要。在昆虫和脊椎动物中，肠道干细胞（intestinal stem cells, ISC）可以再生胃肠道上皮。ISC的功能受到细胞自身、局部和全身刺激的调节，从而可以根据组织需求调节再生。但这些调控能力往往会随着年龄的增长而衰退，导致胃肠道稳态的失调。近年来科研人员在果蝇中深入研究了这种下降的机制并且开始在哺乳动物模型中进行验证。本篇文章主要论述了果蝇胃肠道中年龄相关的再生能力衰退模型，并介绍了近期与年龄相关的哺乳动物ISC功能下降的分子机制研究。

成体干细胞（somatic stem cell, SSC）：局部，全身和细胞的自身调节

大多数动物的组织都有自愈和再生的能力，这种能力使得细胞群能够重新产生满足组织功能所需的各种类型的细胞。这种SSC存在于脊椎动物的许多组织中，通过严格的调控保持其再生能力，同时防止其失调导致发育异常和肿瘤形成。

根据不同组织的需要，不同的SSC以特定的方式被调控和激活：例如，肌肉和上呼吸道中的SSC经常保持静止状态，仅在组织受损后才激活；而小肠上皮内的SSC总是活跃的，提供了连续不断的祖细胞来源，这些祖细胞继续分化为肠腔内的各种类型的细胞。这些SSC通过细胞自身的、局部的和全身性的组合调节来实现其活性与功能的精准控制，通过影响干细胞的功能，进而调控组织的结构与再生能力。这使得干细胞容易受到其微环境以及动物生理状况（包括代谢和炎症状况等）变化的影响。这种敏感性使SSC能够对机体状况的变化做出适当的反应，但也对再生组织的长期健康构成了风险。如随着动物年龄的增长，系统性应激信号趋于升高，导致SSC对损伤的错误应答（图1）。与此同时，SSC长期处于静止状态，这意味着SSC在启动再生反应之前，通常暴露于环境和内在应激源中多年。由此产生的细胞器、DNA、脂质和蛋白质损伤的累积可能导致了SSC再生能力的下降，这在肌肉等组织中尤为明显。

图1. SSC的调节和衰老。

（a）内部的（细胞自身的）、局部的（微环境的）和全身性（系统性）因子调节SSC的维持、静止、激活和分化。（b）在衰老的动物个体中，许多因子的下降或失调导致干细胞损失，干细胞活性失调以及子代细胞的错误分化。

异体共生实验表明，SSC可以通过环境的变化而恢复活力，这提示系统性因子可以缓解这些细胞中积累的失调。这种修复可以改善许多组织的再生能力，并有望开发出促进老年患者组织再生的干预措施。

上皮中的SSC暴露于机体和环境的双重压力时也展现出极强的再生能力和恢复力。了解这些特性并深入探究与年龄相关的SSC变化，对于发展多种慢性炎症性疾病的干预措施至关重要。果蝇胃肠道已经成为一个强大的遗传模型系统，多用于探究生物体年龄相关的上皮再生能力衰退的机制。对ISC活性和谱系调节机制的深入了解涉及了复杂的上皮细胞与微生物的相互作用、先天免疫应答的激活及作为与外部环境接触的半渗透屏障。在过去的十年，通过该模型在细胞自身、局部与全身性因素如何调节ISC年龄相关的活性和功能的研究中取得了重大进展。

本篇综述介绍了目前对引起胃肠道屏障上皮再生衰退的细胞自身的、局部的和全身性的变化的相互作用的理解，特别关注了果蝇模型的成果以及它们如何应用于脊椎动物的干细胞生物学研究。阐明了果蝇和小鼠中ISCs功能与年龄相关变化的原因和结果，并重点关注可能改善干细胞功能、再生稳态和寿命的干预措施。

屏障性上皮：再生、炎症、新陈代谢和免疫力

胃肠道和泌尿生殖道以及呼吸道的上皮细胞具有与众不同的性质，它们暴露于外部环境而与微生物群有紧密相互作用，它们与水、空气、营养物质、免疫因子和消化酶密切接触同时具有半渗透屏障特性，因此这些组织表现出独特的再生能力且包含强大的SSC群体也就不足为奇了。这些组织还表现出独特的可塑性，并且已经进化出多种机制来通过去分化取代损失的干细胞。

上皮细胞的功能多样性表现为再生方式的多样性，这些上皮细胞包括胃部的产酸细胞，气道中的纤毛细胞，以及在小范围内形成隐窝/绒毛结构的上皮细胞。例如在上呼吸道中，基底干细胞大多处于静止状态，仅在组织损伤后才被激活；而在小肠中，隐窝基底的干细胞则大部分处于激活状态，从而不断产生新细胞，形成绒毛上皮。SSC行为的多样性可能是上皮微环境多样性的结果。SSC对生长因子、细胞因子、和细胞连接信号产生反应，并受邻近细胞发出的信号动态调节。因此，要详细了解这些上皮细胞内SSC功能的稳态维持，就需要深入了解在营养缺乏、感染、炎症和机械损伤的情况下，这些局部信号和全身性的信号如何影响SSC。

肠上皮细胞特别容易受到体内稳态失调的影响，因为机械和化学应激会经常破坏上皮细胞，而肠内致病菌的暴露很常见，因此必须控制共生菌群，维持上皮屏障和保障酶与营养素的分泌与吸收。稳态机制的失调很可能是胃肠道营养不良和慢性炎症造成的，而病症可能反过来对上皮再生产生负面影响，并导致发育异常和肿瘤形成。因此了解胃肠道再生、上皮功能、共生菌群和免疫系统之间的各种相互作用对于制定预防和干预胃肠道疾病的措施至关重要。

衰老是多种慢性和炎性疾病的主要危险因素之一，胃肠道疾病也不例外。老年人易患感染性和炎症性疾病，表现在结直肠癌发病率增高、代谢失衡、易患胃肠道感染等。与年龄相关的胃肠道变化不仅可能导致胃肠道炎症疾病的高发，还可能导致个体健康水平和寿命的下降和缩短。一些与年龄相关的并发症，如肥胖、胰岛素耐受和体弱都与胃肠道微生物群的变化有关。

通常导致这类胃肠道疾病发展的条件是恶变前的化生和不典型增生。在人的胃肠道中，上皮化生病变增加了胃肠道癌的风险，此类病变的特征是上皮细胞类型的异位置换。在Barrett化生组织中，食管鳞状上皮具有胃或肠柱状上皮的特征，导致患食管腺癌的风险更高。不典型增生又以细胞异常增殖和分化为特征，被认为是在上皮癌变过程中发生的，并可能促进浸润性癌的发展。

在过去的十年中，果蝇和小鼠ISC的发现、鉴定以及对其年龄相关功能障碍的研究使人们认识到，这些上皮疾病可能是ISC活性和功能的调节改变而导致的上皮再生方向错误的结果。果蝇在这方面是一种特别有效的动物模型，它可以用来详细分析细胞自身的、局部的和全身性的信号机制，这些机制在衰老动物中失调，导致胃肠道上皮内稳态的丧失。将在以下部分中详细描述该模型，并提出一种与年龄相关的果蝇胃肠道组织稳态平衡丧失的模型，该模型也会缩短动物的个体寿命。

果蝇胃肠道干细胞：胃肠道再生的复杂调控模型

果蝇胃肠道为阐明维持屏障上皮完整性的体内平衡机制提供了丰富和有效的模型。果蝇的胃肠道呈伪分层单层上皮组织排列，该组织被局部分隔且被内脏肌肉包围，受神经支配，并与支气管接触。上皮细胞损伤后会被表达Esg（小鼠中干性相关的转录因子）的ISC再生所更新。ISC是具有分泌/吸收功能的多功能再生细胞，如肠上皮细胞和胃铜细胞，以及具有内分泌功能的细胞。ISC的分化潜能在不同部位是多样化的，例如，后中肠ISC主要产生肠上皮细胞和肠内分泌细胞，而胃部的ISC则产生三种不同的细胞类型：肠上皮样细胞，肠内分泌细胞和铜细胞。目前还不清楚这种多样性是在发育中受到ISC的内在因素的调控，还是受到微环境影响的结果。

肠道干细胞增殖的调控

与哺乳动物的小肠不同，果蝇中的ISC增殖是动态的。在稳态条件下，ISC大部分处于静止状态，导致上皮更新相对较慢。而在对应激损伤的反应中，ISC在数小时内被激活，使得受损的上皮细胞能够快速、高效地恢复。感染胃肠道病原菌、DNA损伤、氧化应激或表面活性剂刺激后，均会观察到这种反应。当面临暂时的刺激时（比如轻微感染欧文式菌15，Ecc15），ISC在重建功能上皮后会回到静止期，哺乳动物靠此来应对多重的挑战（尽管会伴随干细胞的逐渐丧失）。ISC的激活会导致不对称分裂，从而使ISC自我更新，以及产生肠内分泌细胞或有丝分裂后的祖细胞，称为肠母细胞。分化为EE或者肠上皮细胞谱系在干细胞水平就已经决定了，并且被Robo/Slit信号通路负反馈调节——EE分泌配体Slit与ISC中的受体Robo结合，阻止其分化为EE。肠母细胞分化为肠上皮细胞受Notch信号的控制，而Notch信号在肠母细胞中被表达在ISCs上的Delta配体激活。ISC还可以在某些情况下进行对称分裂，例如饥饿后再进食而导致肠道生长的适应性调整阶段。

自2006年首次对ISC进行描述和鉴定以来，已经深入研究了刺激后控制ISC激活的机制。通过这些研究已经建立了一个在再生期控制ISC增殖的系统模型。来自受损的肠上皮细胞、血细胞、内脏肌肉和更远的组织的信号刺激了ISC的增殖活性。参与此激活的主要信号通路包括表皮生长因子受体（EGFR）、Jun N末端激酶（JNK）、Janus激活激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT）、骨形态发生蛋白（BMP）和WNT信号通路。这些通路对内脏肌肉中表达的EGF样配体（例如Vein），肠细胞产生的活性氧（ROS）和炎性细胞因子（Unpaireds, Upds），血细胞分泌的BMP样配体（Dpp）以及来自成肠细胞的Wnt样配体（Wg）做出反应（图2）。

图2. 果蝇胃肠道（GI）和肠干细胞（ISC）的调节。

果蝇的胃肠道是分区的，并显示出局部分化再生的胃肠道上皮。主要区室包括前胃（PV），前中肠（AM），包括铜细胞区域（CCR）的中肠（MM），后中肠（PM）和后肠（HG）。（a）显示了胃干细胞（GSSC）和后肠干细胞（ISC）的谱系关系。GSSC被压力激活并产生胃祖细胞（GB），然后可以分化为铜细胞（CC），间质细胞（IS）和肠内分泌细胞（EE）。ISC产生可分化为肠上皮细胞（EC）或EEs的肠母细胞（EB）。（b）展示了ISC静止期和增殖期转换的调控机制。

这些研究中产生的一个关键问题是单一ISC如何整合和转换大量促增殖信号，以响应特定情境的增殖反应。其中一种整合机制是需要同时激活多种途径来刺激ISC增殖。例如已有研究表明，EGFR通路是ISC在稳态条件下增殖所必需的，但并不足以促进ISC增殖，因为静止状态的ISC表现出下游激酶ERK的双重磷酸化。EGF诱导的ERK和ROS诱导的JNK信号的联合激活足以促进ISC增殖且是其必需的。通过在独特的ERK和JNK响应位点上下游转录因子FOS的双重磷酸化来实现这种特异性整合。Ca²⁺ 信号传导是控制ISC增殖的第二种信号整合机制，响应一系列不同的有丝分裂信号通路的激活，可以在ISC中观察到胞质Ca²⁺ 浓度的升高，并且通过刺激CaN和CREB调节的转录共激活因子（CRTC）活性来触发ISC增殖。

这些发现表明ISC从静止状态到激活状态的转变是由上述信号通路协同作用导致的特定的分子变化所调控的。从细胞代谢的角度检验该假设将是有趣的，因为最近的研究表明能量代谢的变化对于维持适当的增殖反应至关重要。ISC增殖受线粒体丙酮酸摄入、线粒体分裂和融合以及脂质代谢的影响。TOR信号通路是营养传感、蛋白质翻译和自噬的中枢协调者，也是ISC有效进入激活状态所必需的。

果蝇和微生物群中的上皮免疫

作为屏障上皮，果蝇肠道上皮与微生物群相互作用且控制它们，并暴露于肠道病原体。这将上皮再生、上皮免疫和炎症紧密联系在一起，可能是对挑战性环境的进化适应。ISC的功能和活性对肠病原体感染具有独特的敏感性，并可能受到微生物群的影响。三种主要的防御机制控制着上皮细胞和细菌菌群的相互作用：围食膜基质，肽聚糖识别蛋白（PGRP）/免疫缺陷（IMD）/Relish通路和p38/磷脂酶Cγ（PLCg）/钙/双重氧化酶（Duox）信号通路。围食膜基质由覆盖在肠上皮的前质体分泌的几丁质和糖蛋白（可能由肠上皮细胞产生）组成。它可以防止微生物和其他管腔内含物与上皮细胞直接接触，且缺失围食膜基质成分的果蝇易于感染。PGRP/IMD/Relish通路响应识别细菌肽聚糖而控制抗菌肽的表达。各种负调控蛋白可使其在静息状态下保持非活动状态，包括Caudal、SC、LB和LF种类的蛋白及PGRP，USP36和PIRK。这些调控蛋白的丢失会导致共生种群的转移、上皮细胞应激信号的激活以及干细胞过度增殖，从而导致上皮发育不良。p38/PLCg/Ca²⁺ /Duox信号通路控制肠细胞产生ROS。Duox是NADPH氧化酶家族的成员，在肠上皮细胞中响应p38 MAPK激活而被转录诱导。它通过涉及磷脂酶Cβ（phos-pholipase Cβ, PLCβ）活化的途径响应细菌攻击而被活化，并触发肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）诱导的Ca²⁺ 释放。Ca²⁺ 结合并激活Duox。上皮细胞产生细胞外免疫相关过氧化氢酶，可保护细胞免受ROS的细胞毒性作用。ROS信号，肠细胞来源的炎性细胞因子（主要为Upds）和内脏肌肉来源的Vein组合可促进ISC对感染的增殖反应，从而确保组织损伤后组织快速再生。

尽管这些防御机制调控上皮对肠病原体的应答，但它们也会与自然菌群互相影响。果蝇肠道的微生物群相对简单，其中包含约5-20种微生物。主要成分为有益微生物（如发霉醋杆菌和植物乳杆菌），它们在限制饮食的情况下可以促进果蝇的生长和发育。与病原生物不同，这些微生物不会激活肠道免疫系统，从而被允许在肠道定植。上皮免疫系统利用尿嘧啶分泌的不同，来区分致病有机体和共生动物，尿嘧啶的分泌由致病细菌（如河弧菌、肺炎克雷伯菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、宋内志贺菌、铜绿假单胞菌和粘质沙雷氏菌等）分泌，而不是由发霉醋杆菌和植物乳杆菌和肠道肠杆菌等共生生物。尿嘧啶诱导Hedgehog（Hh）信号传导，这是钙依赖性细胞粘附分子钙黏着蛋白99C（calcium-dependent cell adhesion molecule cadherin 99C, Cad99C）的肠道表达和随后的Cad99C依赖性内体形成所必需的。这些内体通过充当PLCβ/PKC/Ca²⁺ 依赖性激活Duox信号的平台，在尿嘧啶诱导的ROS产生中起重要作用。

有趣的是，微生物群的物种组成不是肠道内宿主/共生相互作用中稳态的唯一决定因素。最近的研究表明，微生物群的位置也会影响肠道上皮的先天免疫反应和炎症过程。例如，在酸性胃区功能失调的情况下，破坏管腔微环境可以使通常在其他区域定居的细菌异位定植于特定的肠道区域。这也导致微生物群组成的显著变化和对上述炎症反应的诱导。因此，胃区域的丧失已被证实会导致与年龄相关的肠道稳态衰退，并缩短寿命。

微生物群还会产生可影响ISC功能和整体内环境稳态的代谢物。相关研究才刚刚开始揭示微生物群的这种功能，需要更多的研究才能整体把握微生物代谢物对ISC功能的影响。最近的一项研究发现，在植物乳杆菌定植水平升高的情况下，细菌衍生的乳酸会触发肠道NADPH氧化酶Nox的活化，从而导致ROS产生，肠道损伤，ISC过度增殖并缩短寿命。在这种相互作用中，ROS的产生需要宿主肠道内乳酸脱氢酶对乳酸的氧化，这表明宿主基因表达的变化可以调节微生物对组织体内稳态的影响。也有研究表明，与植物乳杆菌的单结合破坏了肠道的稳态并缩短了其寿命，证实了正常有益细菌过度或不平衡定植的有害影响。

衰老与果蝇肠道上皮

免疫和炎症反应以及上皮再生之间协调的需求使果蝇肠道对应激诱导的体内稳态丧失敏感，这在衰老果蝇的肠道中尤为明显。衰老果蝇的肠上皮表现出不受控的ISC增殖和上皮异常增生，这与屏障功能的丧失有关。近年来已对这些表型的前因后果进行了深入研究，现在有可能为衰老的果蝇肠道中的上皮功能丧失提出一个综合模型（图3）。然而，尽管已经大量探索了与衰老相关的细胞组成，形态，信号转导和基因表达的广泛变化和综合变化，以及衰老上皮细胞的再生活性，但关于可能驱动年龄相关的干细胞功能障碍的细胞内在变化，现有的理解仍不完全。在下文中，作者将提出一个与年龄相关的上皮变性的模型，然后对新的研究进行讨论，它们为影响ISC功能的内在分子变化提供了初步认识。

图3. 果蝇胃肠道的老化。

上皮稳态的逐渐失调以及上皮发育异常和屏障破坏的模型。屏障功能的丧失先于果蝇死亡。可以通过将果蝇暴露于蓝色食用染料来测量，该染料仅在屏障功能障碍时才穿透肠道上皮，然后将果蝇变成蓝色。图中展示了导致组织功能障碍进程中不同步骤的通路。铜细胞的JAK/STAT激活（用Cut染色鉴定）导致其转分化和丧失，进而导致管腔酸度丧失（以黄色显示）和菌群失调。中肠后部上皮细胞中的FoxO/Relish（Rel）激活导致共生失调，进而通过激活炎症信号传导（包括ISC中的JNK信号传导）导致上皮发育异常。这些通路的区域或细胞类型特异性扰动可以改善体内稳态并延长寿命。缩写：CC，铜细胞；GI，胃肠道；ISC，肠干细胞；JAK，JAK家族酪氨酸激酶；JNK，Jun N-末端激酶；STAT，信号传导及转录激活蛋白。

果蝇衰老过程中上皮发育异常与微生物群的变化密切相关。最近的研究表明，这些变化是由于胃上皮铜细胞向中肠后部上皮细胞的转分化，继而导致的年龄相关的胃区域管腔酸度下降而造成的。这种化生是由胃上皮铜细胞中的异位JAK/STAT信号传导活性诱导的，也是肠道局部来源和周围组织（如脂肪体）慢性Upd炎性细胞因子表达持续升高的结果。这导致胃腔的酸化不足，以及在前中肠定植的共生生物在中肠后部定植。

后肠的异位定植与微生物群组成的扩展和移位有关。这种失调会触发中肠后上皮中p38/Duox炎症反应的慢性激活，从而导致ROS的长期产生。因此，老化的肠上皮表现出高水平的ROS和ROS诱导的信号传导，如JNK信号传导，血小板衍生的生长因子（PDGF）/血管内皮生长因子（VEGF）信号传导和正常Nrf2信号传导的破坏。长期暴露于此类信号会导致ISC的持续增殖活化和ISC子代细胞的过度产生。上皮异常增生是细胞过度产生的结果，但也与子细胞的分化错误有关。这些细胞表现出异位的Notch信号活性和Dl（Delta）表达，继续表达干细胞标志物（例如Esg），启动但未完全分化成肠上皮细胞，并积累在上皮的基底侧，破坏其结构和功能。

最后，上皮异常增生与上皮屏障功能障碍有关，可用于预测果蝇死亡。因此，多项研究表明，动物的总体寿命与发病年龄和所述肠道变化的严重程度有关。基于所描述的上皮稳态丧失过程中的离散步骤，多项研究测试了针对细胞类型的特定干预措施和时间控制性干预措施，以扰动特定步骤，并能够表明此类干预措施可延长寿命。这些措施包括抑制胃上皮细胞中的JAK/STAT信号传导，调节中肠上皮细胞的天然免疫应答，防止ISC过度增殖以及促进上皮屏障的维持。控制ISC营养供应的干预措施（如热量限制），还可以减少ISC过度增殖并延长寿命。

尽管年龄相关的肠道功能障碍的进展与大量发现相一致，但最近的一些研究表明，因果关系可能比预期的更为复杂，或许存在其他ISC内在因素导致衰老肠上皮稳态的丧失：

1.异常增生与屏障功能障碍之间的确切因果关系仍然难以明确，最近的研究表明，上皮功能障碍可能是肠上皮细胞变化的结果，而这种变化不是由ISC过度增殖介导的。实际上，ISC没有过度增殖的情况下也可以观察到屏障功能的丧失，因此屏障功能障碍可能在衰老的肠道中独立发展，并导致或引起上皮发育异常。最近的一项研究发现，改变分隔连接特异性的蛇毒蛋白（Snakeskin, Ssk）的表达，微生物动力学，免疫活性和寿命。令人惊讶的是，Ssk在肠道的上调可改善衰老过程中的肠屏障功能，限制失调并延长寿命，这表明加强上皮屏障足以抵消上述GI衰老的许多其他因素。进一步强化了细菌的变化、ISC增殖的改变和屏障完整性的丧失可以是不相关的这一概念，发现果蝇三细胞连接蛋白Gliotactin（Gli）在肠上皮细胞中的丧失会导致ISC中应激信号的激活， ISC的增加，甚至焦虑情况下肠屏障的逐渐破坏。仍需进一步研究来详细表征这些表型间的关系。

2. ISC中各种内在的信号传导通路和年龄相关的功能障碍表明，ISC功能障碍的产生可独立于所描述的细菌功能障碍和炎症反应。最近的研究描述了Nrf2活性丧失导致的较老ISCs的蛋白稳定能力的丧失，干细胞和祖细胞中线粒体功能下降，内质网应激增加，逆转录转座子表达的激活以及随之而来的DNA损伤，自噬和异染色质的变化，和聚合酶Ⅲ转录活性增加。所有这些机制似乎都导致了衰老肠道的异常增生，但目前尚不清楚这些过程如何在干细胞水平以及上皮中更广泛的炎症状态中发挥作用。令人吃惊的是，衰老果蝇的ISC也表现出频繁的体细胞突变，导致肿瘤形成，因此，果蝇肠道也可以作为脊椎动物中年龄相关的癌症形成增加的模型。因为在上述研究中，进行针对ISC的扰动后观察到了稳态的改善，甚至在某些情况下延长了寿命，这些与年龄相关的干细胞衰退的内在机制也可以作为干预的靶标。

因此，需要更多的研究来了解这些过程在与年龄相关的上皮功能障碍中的相对作用，并确定从健康的再生上皮发展为ISC功能障碍，上皮异常增生和屏障功能障碍的发展过程中的限速步骤。这些研究将有助于确定能够改善肠道功能且有益于整个生物体健康的干预措施，从而延长健康寿命和寿命。

关键的是，目前在果蝇中研究不足的一个领域是ISC身份的控制和维持。尚不清楚ISC多能性在衰老过程中是否发生变化，而这些变化是否可能导致上皮异常增生，以及维持细胞身份和谱系的机制是否是改善组织功能的有效干预靶点。此类研究正在进行，可以预期不久的将来会获得新的理解。

哺乳动物肠干细胞

哺乳动物的胃肠道比果蝇的胃肠道复杂得多，但是干细胞调控原则，屏障上皮与微生物群的相互作用，以及控制上皮再生的过程似乎是保守的。和果蝇一样，哺乳动物的胃肠道是分隔开的，具有明显的上皮多样性，因此，上皮再生和干细胞调控在胃肠道的不同区域有所不同。在过去的十年中，人们对小鼠胃肠道中的干细胞区室，特别是小肠隐窝中富含亮氨酸的重复序列G蛋白偶联受体5阳性（Lgr5⁺）细胞有了很多了解。使用体内和体外（类器官）小鼠模型来研究干细胞的特性和功能，显著提高了对哺乳动物小肠上皮稳态调节和再生的认知。

小肠中的绒毛由单层上皮组织排列，折叠成无数指状突起，这样的突起伸入肠腔使得消化和吸收的表面积最大化。绒毛之间的管状内凹则称为隐窝，包含干细胞、潘氏细胞和转运扩增（TA）细胞，绒毛包含肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞。潘氏细胞和ISCs分布于隐窝的基底部，并且彼此间紧密相关。潘氏细胞在分泌抗微生物物质和水解酶、溶菌酶的同时，还为ISCs提供营养因子，促进其生存和功能。ISCs自我更新并产生转运扩增细胞，转运扩增细胞沿着隐窝轴向绒毛基部迁移，并在那里发生分化，经历多轮细胞分裂进行扩增。

基于小鼠嵌合体和诱变剂标记细胞的谱系追踪研究，已经预测出了小肠隐窝中的自我更新和多能性ISCs，但直到最近10年才发现ISC的特异性标记。这些研究提出隐窝中两种不同的干细胞群体：表达LGR5的隐窝基底柱状干细胞，这些干细胞在隐窝基底中与潘式细胞嵌套，以及位于隐窝底部上方的四个细胞（+4位置）——表达Bmi1的干细胞。使用Lgr5驱动的诱导性Cre重组酶进行谱系追踪，结果显示从隐窝基底到绒毛尖端的上皮细胞克隆囊括了所有主要上皮细胞类型。Bmi1⁺ 细胞可以自我更新、增殖，并产生小肠的所有不同细胞谱系，从而支持上皮细胞自我更新和隐窝维持，即LGR5⁺ 和Bmi1⁺ 细胞均可在培养过程中产生肠类器官。消除LGR5⁺ 细胞后，Bmi1⁺ 细胞可以恢复为隐窝基础细胞群，这也为隐窝中细胞的可塑性提供了证据。隐窝基底也可以被其他细胞类型（包括已分化的内分泌细胞和潘式细胞）重新填充，这一发现再次支持了隐窝中细胞可塑性的观点。最近的一项研究还提出了一种独特的复兴型干细胞群，它可以在严重损害的情况下重新填充隐窝。

人类结肠隐窝基底细胞也具有多能干细胞的功能，从畸胎瘤中分离出的Lgr5-GFP阳性细胞可以产生长寿命的肠道类器官，这表明在小鼠和人类之间ISC的身份和功能可能是保守的。

除特征明显的小肠隐窝基底干细胞外，胃肠道其他部位的干细胞也得到了一定的研究，包括食道和胃中的干细胞群，它们的再生上皮细胞具有根本性的不同。食管排列着分层的鳞状上皮，缺乏成熟的生态位结构，比如小肠隐窝。附着在基底膜上的一层增殖性基底细胞产生几层分化的细胞，这些细胞脱落到管腔中，被基底细胞衍生的细胞所取代。虽然基底细胞具有干细胞特性，但尚不清楚食道中是否存在独特的具有自我更新和静息能力的干细胞群体。另一方面，胃中排列着由称为胃单元的隐窝样结构组成的上皮细胞，胃单元产生胃酸（在胃体中）或胃泌素（在胃窦中）。这些胃单元峡部的高度增生区含有干细胞样细胞。基于Villin启动子，Lgr5-Cre或Sox2-Cre驱动的Cre重组酶谱系追踪已经明确了沿幽门腺、幽门基础腺体，以及幽门和腺体峡部附近的干细胞群体。在胃单元底部的Troy⁺ /Mist⁺ 主细胞被认为可作为储备干细胞，在很长一段时间内再生所有细胞类型。

对哺乳动物胃肠道中大多数干细胞群体的调控与维持的认识仍然很模糊，而基于干细胞生态位的角度对小肠中Lgr5⁺ 隐窝基底细胞的研究，让人们对ISC的维持和调控有了更好的了解。多种信号通路控制着ISC的活动和功能，包括Wnt、BMP和Hh以及Notch信号。最重要的一点是，沿隐窝轴的Wnt活性梯度可维持ISC的再生能力，而Wnt活性的丧失则导致肠隐窝的完全消除，Wnt信号进一步决定了隐窝内的细胞命运以及空间结构。

不增殖的潘式细胞的终末分化需要高Wnt活性，这种作用是由Wnt靶基因Sox9介导的，反过来，BMP信号可能通过抑制Wnt信号来负调控ISC的增殖和自我更新。Notch信号也可以维持干细胞和祖细胞的增殖，而在果蝇肠道中，Notch的激活促进分化，小鼠中抑制Notch信号转导可能通过Wnt途径的激活将LGR5⁺ ISCs转化为分泌细胞，而隐窝中的Notch的异位激活会导致增殖细胞的扩张，并抑制分泌细胞类型的产生。

在整个小肠和胃的幽门区域都可以发现表达Lgr5的干细胞，但在胃体和食管上皮中却没有发现。不同水平的Wnt信号活性可能促进了这种多样化的形成：尽管需要Wnt才能在远端幽门区域维持基底干细胞，但胃体中Lgr5^- 干细胞却表现出不同水平的Wnt活性。

肠道炎症

与果蝇中的IMD/Relish途径相似，哺乳动物肿瘤坏死因子受体（TNFR）途径激活Relish同源核因子-κB（NF-κB）对于上皮免疫至关重要。上皮细胞中NF-κB的激活可以调节免疫应答，并且上皮细胞中NF-κB和TNFR通路的长期激活会导致肠道炎症。ISC的调节在肠道炎症和炎性疾病中的作用很复杂，而且针对ISC功能的干预措施可能有助于改善炎性肠道疾病的病程。比如说使用白介素（IL）-22作为炎性肠病的一种可能治疗措施。

ISCs也可能通过饮食扰动对炎性肠病产生有益影响。小鼠结肠炎模型的最新研究表明，短时间禁食后再进行正常饮食可以调节肠道微生物群，并对小肠中的炎症，干细胞增殖与组织维持产生有益作用。相应的，ISCs会对饮食变化（饮食限制对年轻和年老小鼠的ISC活性均具有有益影响）做出反应，即使是短期（24小时）禁食也是有好处的，因为它通过诱导脂肪酸氧化来增强ISC功能。

令人惊讶的是，哺乳动物的饮食与肠道屏障功能障碍之间可能存在联系，最近的一项研究报告指出，高血糖症可增强肥胖和糖尿病小鼠模型的肠屏障通透性，这种作用是由肠上皮细胞中依赖GLUT2的转录调节以及紧密连接完整性的改变所介导的。治疗高血糖症，清除肠上皮细胞中的GLUT2或抑制葡萄糖代谢可恢复肠道屏障功能和细菌遏制作用，该研究进一步表明，肠道微生物组产物的全身性流动与人体的个体化血糖控制有关。

衰老如何影响这些不同的生理参数、炎症信号和上皮细胞再生控制，以及它们之间如何相互作用，影响哺乳动物肠道中与年龄相关的变化，目前仍不清楚，最近的研究开始对年龄相关的ISC功能障碍相关问题进行了深入的探讨。

哺乳动物肠道中的衰老

与果蝇肠道相比，哺乳动物肠道上皮细胞的年龄相关变化仍处在研究当中。20世纪90年代的研究报道了小鼠小肠修复能力随年龄增加下降，在高剂量辐照后，28到30月龄的小鼠表现出肠道隐窝大小和数量上的显著下降。之后，有研究表明，短端粒和ROS诱导的DNA损伤导致了肠上皮细胞再生能力的下降。最近在小鼠上的研究发现，果蝇中描述的与年龄相关的体内稳态丧失，包括微生物营养不良，肠道屏障功能障碍和全身性炎症，在哺乳动物的胃肠道中也存在。研究还发现在无菌环境中饲养的小鼠可阻止与年龄相关的促炎细胞因子的增加，进而延长寿命，共居实验进一步证明，用传统方法饲养的年老而非年轻的小鼠可以将促炎状态转移到无菌小鼠身上。

然而，这些研究没能直接探究ISC的功能，也没有探索与年龄相关的局部或全身性变化之间的相互作用，用以揭示与年龄相关的修复能力下降的原因。最近的一系列研究利用了过去十年对小鼠ISC生物学的深入了解，开始阐明衰老对ISCs的影响。与年龄相关的小肠Lgr5⁺ ISCs的功能变化是一个研究重点。Nalapareddy和他的同事曾指出，与年轻小鼠相比，老年小鼠肠上皮的结构、细胞数量和细胞组成均发生了变化，同时老年小鼠ISCs的再生能力也下降了。形态学上的改变包括隐窝数量减少、隐窝长度和宽度增加、绒毛长度增加以及每个隐窝细胞数量的增加（图4）。这进一步表明，在隐窝的底部观察到的增生细胞更少，并且与幼年小鼠相比，成年小鼠中ISCs的数量没有变化，但其功能却下降了，从而导致老年小鼠中更少的由谱系追踪到的Lgr5⁺ 细胞衍生克隆。这与衰老小鼠隐窝中干细胞特异性基因表达的减少，尤其是Wnt通路基因表达的减少，以及损伤后组织修复的减少是一致的。值得注意的是，在体外培养的隐窝类器官中也可以观察到这种ISCs功能障碍，与来源于年轻小鼠的隐窝类器官相比，培养三代后其活力会降低，隐窝样芽结构会减少。最近的一项研究发现，人类结肠隐窝类器官形成能力的年龄相关性的下降可能是由于干细胞自主性变化和/或旁分泌生态位因子变化的结果。据此，Pentinmikko等人表示，与年轻小鼠的潘式细胞共培养可以部分挽救老年Lgr5⁺ ISCs的类器官形成缺陷，Nalapareddy及其同事发现，将小鼠类器官暴露于高水平的Wnt3a足以挽救与年龄相关的表型。虽然肠道上皮中的Wnt信号对于年轻小鼠的组织稳态至关重要，但隐窝中Wnt配体表达和Wnt途径活性的调节非常复杂，还需要进一步的工作来明确隐窝衰老过程中Wnt信号下降的原因和结果。Pentinmikko和其同事提出了一种机制：衰老潘式细胞中分泌的Wnt脱酰基酶Notum的增加导致了Wnt信号的下降。

图4. 小鼠小肠干细胞区室的衰老。

目前的研究表明小肠隐窝的衰老变化可以通过特定的干扰来逆转，（a）比如Wnt信号或补充烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺），卡路里限制（CR），及能诱导肠干细胞（ISCs）进行脂肪酸氧化（FAO）的禁食。（b）年龄相关的变化是多元的，需要进一步了解分子变化，组织形态学紊乱和功能改变之间的关系。

一些研究也报道了时而相似，时而矛盾的ISCs衰老表型：Moorefield等人称18至22月龄的小鼠绒毛高度和潘式细胞增加，ISC增殖加快和ISC群体扩张，同时还证明老年小鼠产生更少的隐窝类器官和更少的复杂类器官，作者还发现老年小鼠肠上皮细胞凋亡增加。Cui及其同事发现，来自24个月的小鼠的ISCs形成了缺乏分化细胞的类囊肿类器官，这种类器官具有典型的Wnt信号升高的特征。据此，Cui表示Wnt靶基因在老年小鼠隐窝中高表达，并且减少培养物中的R-spondin-1可以抑制囊肿表型。

衰老小鼠肠道隐窝中Wnt信号活性的相关研究结果存在差异，这也是难以确定衰老小鼠肠道再生功能障碍的原因。至关重要的是，如果事实上在老年隐窝中Wnt信号活性降低，而Wnt通路活性的增加或维持会导致结直肠癌，那么恢复隐窝再生能力的途径就会变得复杂化。因此，最近在结肠中描述了与年龄相关的分子变化与大肠癌倾向增加之间的联系：与来自年轻小鼠的类器官相比，老年小鼠的结肠衍生类器官中，启动子超甲基化（模仿人类衰老表型）会促使自发表观遗传沉默，激活Wnt途径，导致茎状状态和分化缺陷，对Braf^V600E 的转化敏感性更高。

尽管衰老小鼠ISCs的确切表型尚未明确，但已有多项研究报道了潜在的干预策略来恢复其功能。Mihaylova等人发现禁食可以通过诱导脂肪酸氧化来促进ISC功能；Yousefi等人指出，在抗损伤储备型ISCs中，限制卡路里的摄入可通过抑制mTORC1来提高肠上皮的再生能力。mTORC1活性对于许多SSC类型向活跃状态的过渡至关重要，它可以通过促进分化而显著损害这些细胞的功能。因此，暴露于雷帕霉素可显著改善衰老小鼠呼吸道基底干细胞的维持能力。老年小鼠的ISC功能可以通过使用Notum抑制剂ABC99得到恢复。

另一项研究发现，在衰老小鼠中，ISCs而不是潘式细胞的数量和增殖活性下降，并且这些细胞中SIRT1和mTORC1活性水平下降，用NAD⁺ 前体烟酰胺核糖苷治疗可以逆转这种表型，并能促进肠道损伤的修复。令人惊讶的是，这种作用可以被雷帕霉素或SIRT1抑制剂EX527所阻断，这些发现与前面的一些结果形成了鲜明对比，也表明需要更多的研究来解决这些争议。似乎有两个主要因素一起导致了不同的观察结果：（a）在小肠中缺乏对区域差异性的关注；（b）仅使用单一时间点来观察老年小鼠表型。针对第一个问题，或许需要详细描述胃肠道不同区域分离的ISCs中与年龄相关的变化，解决第二个问题则需要同时在各个时间点更全面地描述与年龄相关的功能障碍小鼠的寿命。

还需要其他技术详细了解体内的干细胞功能，以此获得衰老动物中ISC功能障碍的更全面、更可靠的图像。较突出的实时成像技术虽然在小鼠中需要大量的技术投入，却可以更加清晰的了解内稳态和衰老动物中ISC功能。Choi等人最近报道了肠道隐窝局灶性损伤后ISCs的协调运动，这使潘式细胞与ISCs的嵌套得以重建。此过程在老年小鼠隐窝中受损，表明衰老动物肠道中再生能力的下降不仅是ISC增殖或分化能力降低的结果，而是细胞运动性的结果，这种年龄相关性的下降的机制目前仍然不清楚。

结论

对果蝇胃肠道中年龄相关变化的详细描述促成了ISC功能障碍分子模型的建立。该模型为在脊椎动物中类似功能的研究提供了一种假说，促进了恢复老年人组织功能、治疗胃肠道上皮炎症和干预再生障碍疾病等相关领域的发展。深入探索哺乳动物ISC的衰老需要扩展这方面的工作，同时严格验证从果蝇模型得出的假说，以期在理解ISC衰老的基础上开发相应的治疗方法。

责编：蒋晓钰

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