多能干细胞与CAR-T细胞免疫治疗（下）

撰文│郭明岳  王译萱

编辑│郑天慧  陈圆圆

审校│汤红明

胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）具有无限增殖和分化成其他类型细胞的能力。将ESCs或iPSCs分化为自然杀伤细胞、巨噬细胞或T细胞等免疫细胞可以为癌症的细胞免疫治疗提供不竭的细胞来源。CAR-T细胞免疫治疗技术的开创和成功应用为肿瘤的治疗甚至治愈带来了希望。为了提高CAR-T细胞免疫疗法的特异性、安全性和通用性，使用基因编辑技术改造CAR-T细胞已变得至关重要。原代免疫细胞由于增殖能力有限一定程度上降低了基因编辑效率。拥有无限增殖能力和向T细胞分化能力的多能干细胞(PSCs)，尤其是不涉及伦理问题的iPSCs成为基因编辑和无限产生T细胞的理想选择。

一、多能干细胞来源的T细胞

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T细胞是人体免疫系统的重要组成部分，在适应性免疫中起着至关重要的作用。T细胞通过T细胞受体（T cell receptors，TCR）识别抗原提呈细胞表面的主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex , MHC）来识别经抗原提呈细胞加工处理的抗原肽，然后在共刺激分子的作用下活化、增殖和分化为效应T细胞，产生效应分子清除抗原。

多项研究报道了将人的PSCs分化为功能性T细胞的方法。来源于小鼠骨髓的OP9细胞系作为基质细胞可以促进PSCs分化为表达CD34标志分子的造血细胞，并且之前将外周血或脐带血分化为T细胞的研究表明Notch信号是T细胞生成所必须的。将OP9细胞改造为表达Notch配体Dll-1的基质细系（OP9-DL1），可以成功地将共培养的ESCs分化为表达功能性标志分子CD4和CD8的T细胞。有研究报道通过类器官技术将人的ESCs或iPSCs分化为功能性T细胞，该方法中使用表达Notch配体DLL-4的MS5细胞代替了OP9-DL1。也有研究将来自HIV病毒感染者的血液细胞诱导为iPSCs，然后与OP9-DL1细胞共培养分化为T细胞，所得到的T细胞表现出很高的增殖活性和延长的端粒，这表明来源于iPSCs的T细胞具有在重编程过程中获得活力恢复的优点。在T细胞的实际临床应用中，应避免基质细胞的使用来提高安全性，目前已成功建立了不依赖于基质细胞的分化方法。

二、国外多能干细胞在CAR-T细胞中的研究与应用

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美国Fate Therapeutics公司的FT819是第一个来源于iPSCs的CAR-T细胞免疫治疗的产品，2020年7月获得了FDA的新药研发批准。该公司首先将外周血来源的T细胞诱导为iPSCs进行基因编辑改造，然后扩增分化为T细胞进行功能性验证。

在基因编辑方面将靶向CD19肿瘤细胞的CAR插入到基因组TCR的位置，破坏TCR的表达可以避免GvHD的发生，提高安全性。同时，敲除β2m和CIITA来消除HLA I类和II类分子的表达来避免HLA配型的需求，从而达到真正通用的目的（如下图）。但是缺少HLA I类分子的异体细胞会被宿主NK细胞排斥，之前的研究证明表达HLA-E，HLA-G或宿主特异性HLA-C可以缓解NK细胞介导的排斥，Fate Therapeutics公司选用的是HLA-G/B2M融合蛋白。此外，FT819具有双重靶向能力，高亲和型CD16的基因敲入可以解决CD19阴性肿瘤细胞逃逸的问题。

● ●● 图 ：多能干细胞经过基因改造，成为肿瘤特异性 T 细胞，具有理想的免疫治疗特性 

摘自 Nianias, A., Themeli, M. Induced Pluripotent Stem Cell（iPSC）-Derived Lymphocytes for Adoptive Cell Immunotherapy: Recent Advances and Challenges. Curr Hematol Malig Rep.2019

Fate Therapeutics公司的临床前数据显示，由基因编辑后iPSCs来源的CAR-T细胞FT819均匀表达的CAR，完全不表达TCR并且可以大量扩增。为了证明FT819由于TCR的缺失不会引起GvHD，将FT819、含有TCR 的原代T细胞以及CAR -T细胞分别与HLA不匹配的外周血单核细胞（PBMC）共培养。与原代的T细胞和CAR-T细胞相比，基因编辑后iPSCs来源的CAR-T细胞FT819没有对PBMC产生免疫响应。

体外功能性研究数据显示，FT819对CD19细胞具有有效的抗原特异性免疫反应，产生细胞因子IFNγ和TNFα，以及穿孔素和颗粒酶B等介导肿瘤细胞死亡的因子。体内研究表明在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，FT819可有效控制肿瘤生长。为了验证FT819同时靶向多种目的抗原的能力，在CD20单克隆抗体存在下，由基因编辑后iPSCs来源的CAR-T细胞可以有效地识别和消除CD19阴性CD20阳性的肿瘤细胞。这些临床前研究表明FT819是一款有效的iPSCs来源的CAR-T细胞治疗产品。FDA的批准使得Fate Therapeutics公司可以进行临床1期试验，目前该公司针对慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等B细胞恶性肿瘤进行试验来确定FT819的安全性、有效性和最大耐受剂量。

三、国内多能干细胞在CAR-T细胞中的研究与应用

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中科院广州生物医药与健康研究院王金勇课题组开发了“体外编辑分化，体内成熟”两步法研究PSCs来源的CAR-T细胞治疗技术。该技术首先对PSCs进行基因编辑，将诱导型Runx和Hoxa9整合到PSCs的基因组中。Runx和Hoxa9的合适表达会促进PSCs向造血内皮细胞的分化及在OP9-DL1细胞的帮助下促进造血祖细胞的成熟。然后将成熟的造血祖细胞移植到免疫缺陷受体小鼠中进行体内T细胞的重建。移植后5周，在免疫缺陷小鼠受体的脾脏中检测到了供体来源的成熟T体细胞。通过合适的TCR基因编辑改造后，这些体内成熟的T细胞具有明显的抗实体肿瘤的活性。

最近该研究团队又对这项技术进行了进一步的临床转化评估。将PSCs来源的造血祖细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，之后分选出成熟的T细胞，通过逆转录病毒进行靶向CD19肿瘤细胞CAR的整合。为了测试CD19-CAR-T细胞是否能在体外清除肿瘤细胞，研究者将CD19-CAR-T细胞与B淋巴瘤Ka539细胞共培养了36 小时。结果显示CD19 阳性的Ka539细胞数量急剧下降，这表明PSCs来源的CD19-CAR-T细胞在体外显示出非常强大的抗肿瘤活性。同样，在B细胞淋巴瘤小鼠模型体内，CD19-CAR-T细胞也表现出强大的持续抗肿瘤能力。

虽然这项研究使用的是小鼠的研究系统，但是对人的PSCs在CAR-T细胞免疫治疗中的应用有着重要的参考意义。启示我们在使用PSCs进行CAR-T细胞治疗时，不仅可以通过基因编辑来提高安全性，还可以通过对重要基因的表达控制来提高CAR-T细胞的疗效，并且不一定需要移植大量体外分化的CAR-T细胞，而是可以通过移植CAR-T细胞的前体细胞，使其在病人体内根据需要大量增殖和成熟。

四、展望

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随着PSCs在CAR-T及其他细胞免疫治疗中研究的深入，相信不久PSCs来源的通用型异体细胞免疫疗法在临床上的应用将由理论变成现实。在此之前，安全性仍然是最应该考虑的问题，相关研究机构及医药监管部门应该建立严格的生产标准，来确保来源于PSCs的通用型CAR-T细胞治疗产品的安全高效，并实现GMP条件下的规模生产。

（本文来源于《医学参考报》干细胞与再生医学专刊2020-06期第3版文章，ID：yxckbsc2020060301），图片来源于网络，如有侵权，请联系删除。）

专家简介

王译萱

博士生导师，同济大学生命科学与技术学院教授，同济大学附属东方医院再生医学研究所特聘研究员。长期从事以人诱导多能干细胞技术和原态多能性诱导为基础的体细胞重编程应用和机制研究。主持国家自然科学基金面上项目 3 项，主持上海市“扬帆计划”及“晨光计划”项目，并承担科技部“973”项目 3 项。2020 年获国家优秀青年科学基金。第一／通讯作者论文发表于Cell Stem Cell、Cell Research、Nature Communications、Elife 等期刊。

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