抑制EGFR-ERK-SOX9轴可促进斑马鱼体内肝祖细胞诱导肝再生

撰文│杨羊  何志颖

编辑│郑天慧

审校│汤红明

据【《Hepatology》2020年7月报道】题：抑制EGFR-ERK-SOX9轴可促进斑马鱼体内肝祖细胞诱导肝再生（作者Juhoon So等）

肝脏是一个高度再生的器官，轻度肝损伤时，主要以肝细胞增殖的方式修复受损肝脏。然而重度肝损伤时肝细胞增殖受到损害，肝祖细胞(LPCs)被激活并继续增殖和分化为肝细胞，从而促进再生。但这种LPCs诱导的肝再生在晚期肝病患者体内似乎没有发生，目前肝移植是晚期患者唯一的治疗选择。慢性肝病中LPCs的数量与肝病的严重程度成正比，意味着LPCs的激活很强，但它们在患者体内分化为肝细胞的效率很低，这种低效分化加重了疾病。此外，LPCs还会分泌促炎症细胞因子，故长期存在会加剧炎症和纤维化。因此，促进晚期肝病患者的LPCs向肝细胞分化，产生更多的功能肝细胞，同时减少炎症和纤维化，可能是一种很有前途的临床治疗方法。

EGFR通路通过促进肝细胞增殖在肝细胞诱导的肝再生中起积极作用，还在不同的肝损伤环境中保护肝细胞。据报道，肝特异性Egfr基因敲除小鼠的肝功能比对照组更好，含有更多的A6⁺/HNF4A⁺双阳性细胞，这些细胞被认为是正在分化为肝细胞的LPCs，表明Egfr基因敲除小鼠中LPCs向肝细胞分化在增强。EGFR通路还调节肝星状细胞的激活，EGFR抑制剂处理可减轻肝纤维化。目前临床中EGFR抑制剂被用于治疗EGFR突变的非小细胞肺癌患者。尽管具有抗肿瘤作用，但在肿瘤形成后给予EGFR抑制剂处理并没有减少肿瘤生长，而在肿瘤形成前处理降低了肿瘤发生率，表明EGFR抑制剂对癌前状态的细胞有抗肿瘤作用。此外，SOX9在各种组织中能维持干/祖细胞的状态，并抑制其分化。最近有研究报道了Sox9b在肝细胞完全敲除的斑马鱼模型中抑制LPCs向肝细胞分化。

美国匹兹堡大学肝脏研究中心的Juhoon So课题组发现抑制EGFR-ERK-SOX9轴可促进斑马鱼体内LPCs诱导肝再生，该成果发表在2020年7月的Hepatology上。

课题组首先建立了一种新的斑马鱼模型，即Tg(fabp10a:pt-β-catenin)^s704，在肝细胞中组成性激活β-catenin的表达，在肝细胞特异性Fabp10a启动子下，肝细胞中表达Xenopus β-catenin的突变、稳定形式，诱导肝损伤和随后的LPCs诱导肝再生，其中LPCs在肝脏损伤时缓慢分化为肝细胞。在Tg(fabp10a:pt-β-catenin)中，观察到肝脏中tp53及其靶基因p21和mdm2的表达量增加，同时检测到肝细胞出现DNA损伤、凋亡和衰老。慢性肝病中，肝细胞损伤可引起炎症及随后的LPCs激活和纤维化。与对照组相比，Tg(fabp10a:pt-β-catenin)的肝脏中巨噬细胞和肝星状细胞的数量显著增加，即引发炎症；同时也观察到肝纤维化，而在对照组中则没有。

为了标记胆管上皮细胞(BECs)和LPCs，课题组使用Tg(Tp1:H2B-mCherry)^S939和Tg(Tp1:VenusPEST)^S940，前者在BECs/LPCs 核中表达具有较长半衰期的H2B-mCherry融合蛋白，后者在BECs/LPCs细胞质中表达具有较短半衰期的VenusPEST。发现肝细胞标记物Bhmt最初在Tg(fabp10a:pt-β-catenin)的所有肝细胞中表达，但在15dpf时几乎检测不到。fabp10a:CFP ^weak/Tp1:H2B-mCherry^weak双阳性的细胞被认为是LPCs，在10dpf时出现，15dpf时表达丰富。表明15dpf时肝细胞已消除，LPCs开始出现并富集。在15dpf后Bhmt的表达逐渐恢复，20dpf时小簇细胞表达Bhmt，30dpf时约70%肝脏区域为Bhmt⁺细胞，提示LPCs诱导了肝细胞再生。通过qPCR分析肝细胞标志物(bhmt、ces2、gc、serpina1、tdo2a)和BECs/LPCs的标志物(epcam、her9、krt18、sox9b)，进一步提示LPCs诱导了肝再生。

图1 在肝脏中过表达β-catenin或UHRF1可诱导肝损伤并诱导LPC介导的肝再生

课题组还证明了体内本身存在的肝细胞和BECs均对再生肝细胞起作用，利用遗传命运图谱前瞻性地确定了Tg(fabp10a:pt-β-catenin)中再生肝细胞的来源。由于肝细胞和BECs都能产生LPCs，分别用Tg(fabp10a:CreERT2)^pt602和Tg(Tp1:CreERT2)^s959对肝细胞和BECs进行示踪，发现30dpf时Tg(fabp10a:pt-β-catenin)本身存在的肝细胞和BECs都参与了再生肝细胞的生成，其中本身存在的肝细胞去分化为LPCs，后者再分化为肝细胞。还观察到，本身存在的BECs而不是肝细胞，对BECs的生成有贡献。

图2 Tg(fabp10a:pt-β-catenin)和Tg(fabp10a:UHRF1-GFP)斑马鱼中现存的肝细胞和BECs都可导致肝再生

为了鉴定能促进LPCs向肝细胞分化的化合物，课题组利用Tg(fabp10a:pt-β-catenin)模型进行了一个全动物小规模的化合物筛选。利用特异性抑制剂重点研究与肝脏发育或再生相关的信号通路，包括AG1478(EGFR)、LY411575(Notch)、SB431542(TGFβ)、DMH1(BMP)和cyclopamine(Shh)。13~15dpf时，每种抑制剂处理Tg(fabp10a:pt-β-catenin)，15dpf时检测Bhmt的表达，此时LPCs普遍存在但肝细胞几乎不存在。发现AG1478的处理明显增加Bhmt⁺肝细胞数量，同时减少LPCs数量，提示LPCs向肝细胞的分化增强了。同时AG1478处理的Tg(fabp10a:pt-β-catenin)，胆小管的形成和胆汁分泌有改善，也提高了斑马鱼的生存期，减少了肝纤维化。LY411575也增加了Bhmt⁺肝细胞的数量，但效果低于AG1478。15dpf时Tg(fabp10a:pt-β-catenin)肝脏中egfra的表达比对照组增多，存活到成年的egfra^ct870杂合和纯合突变体，Tg(fabp10a:pt-β-catenin)中LPCs向肝细胞分化增强。这些结果表明，抑制EGFR通路能促进LPCs向肝细胞分化，修复受损肝脏。此外，AG1478的处理也促进了肝细胞和BECs诱导的LPCs向肝细胞分化，进一步证明了无论LPCs来源于哪种细胞，抑制EGFR通路均促进LPCs的分化。

图3 抑制EGFR信号通路可促进LPC向肝细胞分化

鉴于抑制EGFR通路的促再生作用，课题组进一步探索EGFR通路调节LPCs向肝细胞分化的分子机制。EGFR通路主要通过3个下游介质MEK/ERK，PI3K/AKT和JAK/STAT3发挥功能，分别使用它们的抑制剂(MEK/ERK的U0126，PI3K/AKT的LY294002，JAK/STAT3的JSI-124)，发现U0126的处理促进了LPCs向肝细胞分化，但LY294002或JSI-124的处理没有促进。与该结果相一致，在AG1478处理的Tg(fabp10a:pt-β-catenin)肝脏中，pErk1/2的表达比对照组明显减少。此外，还利用Tg(hsp70l:dnHRAS)^pd7在热休克时过表达dnHRAS，通过肝细胞标记物bhmt、cyp2ad2、cyp7a1a和tdo2a的表达，dnHRAS过表达的Tg(fabp10a:pt-β-catenin)表现出LPCs向肝细胞分化增强，进一步揭示抑制EGFR通路对LPCs分化的作用是经MEK/ERK诱导的。课题组还构建了一个转基因株系Tg(fabp10a:rtTA,TRE:Venus-KRAS)^pt618，在多西环素处理时，表达了一种组成性活化形式的KRAS与Fabp10a启动子控制的Venus相融合。AG1478处理的Tg(fabp10a:pt-β-catenin) 肝脏中KRAS的肝向诱导激活了Erk1/2， Bhmt表达被严重抑制。总之，这些结果表明EGFR通路经MEK/ERK级联调节LPCs向肝细胞分化。此外，AG1478处理2天，明显增加Bhmt⁺细胞面积，同时减少30dpf时Bhmt^-发育不良区域。其他2个肝细胞标记物ces3和gc的表达，也表明AG1478处理2天后肝细胞面积的增加。同时，U0126的处理也增加了Bhmt⁺细胞面积，减少了发育不良区域。这些结果进一步支持EGFR-MEK-ERK轴在LPCs向肝细胞分化中的关键作用，并提示在慢性肝病中增强LPCs向肝细胞分化的益处。

图4 EGFR信号通路通过MEK/ERK通路抑制LPC向肝细胞分化

此外，课题组还发现EGFR通路经Sox9b抑制LPCs向肝细胞分化。由于EGFR通路经MEK/ERK诱导尿路上皮细胞和胶质母细胞瘤中SOX9的表达，推测Sox9b可能作为LPCs诱导肝再生中EGFR通路的关键下游分子起作用。Tg(fabp10a:pt-β-catenin)肝脏中Sox9b表达较高，但AG1478的处理明显降低了Sox9b的表达。Tg(fabp10a:rtTA,TRE:Venus-KRAS)系对KRAS的肝向诱导，消除了AG1478处理抑制Tg(fabp10a:pt-β-catenin)肝脏中Sox9b表达的影响。此外，用Tg(ubb:loxP-CFP-loxP-sox9b-2A-mCherry)^jh47和Tg(fabp10a:CreERT2)系在LPCs中过表达Sox9b，消除了AG1478处理促进Tg(fabp10a:pt-β-catenin)中LPCs向肝细胞分化的影响，即抑制了LPCs向肝细胞分化。此外，sox9b^fh313杂合突变体在15dpf时表现出LPCs向肝细胞分化增强，30dpf时Bhmt⁺细胞增多和Bhmt^-发育不良区域减少。这些结果表明，EGFR通路经Sox9b调节LPCs向肝细胞分化。

图5 Sox9b抑制LPC向肝细胞分化

总之，该课题组建立了一种新斑马鱼模型，用于研究LPCs诱导肝再生。利用这一模型，确定EGFR抑制剂是能促进LPCs诱导肝再生的有效化合物，特别是促进LPCs向肝细胞分化。还发现EGFR通路经ERK-SOX9轴在LPCs诱导肝再生中抑制LPCs向肝细胞分化。而且EGFR抑制剂的短期治疗会导致肝脏长期更好的修复。因此，本研究的发现提示EGFR抑制剂可作为晚期肝病患者的一种促再生治疗药物。

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