干细胞产品质量评价体系标准的建立及实践
撰文│鲍 嫣 白志慧 张守梅 朱邯豫
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
干细胞，因具有再生组织和人体器官的潜在功能，在医学界常被称为“种子细胞”或“万用细胞”，应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，为很多难治性疾病的治疗带来希望。
用于细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞及诱导多能干细胞。由于干细胞产品具有传统医药产品不具有的多样性、复杂性及不稳定性，因此临床应用干细胞产品时，需结合科学性和制备工艺的风险因素，全面把握干细胞产品的质量属性，对其细胞属性、安全性和生物学效力等方面进行质量研究和质量控制。因此，建立科学性标准化的干细胞质量评价体系，包括确定通用性的临床级干细胞的质量检测内容和检测标准，并对不同种类干细胞制剂开展关键质量属性研究以完善干细胞质量的评价技术、评价标准和评价规范，对于干细胞产业化发展具有决定性推动作用。
一、临床级干细胞的质量评价
临床级干细胞的质量评价需要建立成熟完善的质量检测体系，即保障不同组织来源的干细胞制剂质量属性/质量要求的体系，包括相关的质量检测流程、检测指标、检测方法及评价标准等。根据干细胞产品的细胞类型、制备工艺、生产阶段、质检目的等不同要素，临床级干细胞制剂的质量检测应包括准入检验、质量检验、放行检验及复核检验。
（一）准入检验
由于临床干细胞制剂是通过采集供者的骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜、外周血等组织或细胞进行分离、扩增、筛选、制备等操作获得，而供者的既往病史、家族史、性别、年龄、血型及组织相容性等因素非常复杂。为避免供者遗传因素及病史所造成的干细胞制剂的毒性和病原体感染的风险，保证干细胞制剂来源的安全性和可控性，必须在供体组织或细胞进入实验室制备前进行准入检验。
根据制剂来源的不同，准入检验主要分为两种类型：
1. 来源为组织或血液
准入检验主要检验提供组织或血液的供者，包括筛选人源特定病毒（HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV 等）的感染、梅毒螺旋体感染。必要时需要收集供者的ABO血型、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分型资料，以备追溯性查询。
对用于异体干细胞临床研究的供者，病毒检验结果须为阴性。若用于自体干细胞临床研究的供者，病毒检验为阳性样本，则须根据临床研究方法进行酌情确认，为确保制备间环境和人员的安全性，对此类样本的实验操作必须在负压环境下进行。
2. 来源为细胞制剂（细胞制剂应该有源头）
准入检验主要检验干细胞制剂的微生物安全性，包括人源特定病毒（HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV 等）及梅毒螺旋体的检测，以及无菌、支原体、内毒素等检验。该病毒报告针对细胞制剂而非供者，只有上述检验均为阴性，方可允许样本准入，进行干细胞制剂制备。
（二）质量检验
干细胞制备是一个复杂的过程，供体来源的组织或细胞样本需经过组织分离、原代培养、纯化扩增、冻存保存、复苏调配等操作步骤，这一制备过程将引入蛋白酶、胶原酶、动物血清、病毒因子、抗生素等外来物质，且可能会引入支原体、细菌、真菌等病原微生物的污染，也可能对细胞的活率纯度、生物学活性、核型稳定性、端粒酶、增殖能力、分化潜能乃至基因表达等干细胞制剂的关键质量要素造成影响，因此规范评估制剂质量安全性和有效性是干细胞临床应用的重要先决条件。而质量检验正是以评价整个生产工艺的质量及稳定性为主要目的，是干细胞临床研究所需的最为重要的一种评价规范，其理念和内涵适用于包括各类干细胞产品在内的所有治疗性细胞产品。
根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》，为确保干细胞治疗的安全性和有效性，每批干细胞制剂均须进行质量检验，其质量须符合现有干细胞知识和技术条件下的全面质量要求。
质量检验项目包括：
1. 细胞属性评价，包括细胞鉴别、细胞存活率及生长活性、细胞纯度及均一性检测。
细胞鉴别内容包括细胞的形态学、遗传学、代谢组学、
生物学标志物及独特的生物学功能等属性构成。
细胞活性包括细胞的活率、增殖周期、倍增时间、端粒酶活性/长度、克隆形成率等特性。
细胞纯度和均一性检测主要是评估细胞在制备过程中引入的其他滋养细胞、培养过程中的混杂细胞的情况，以及相同来源相同细胞类型相同代次细胞的表型及生物学特性的均一性。
2. 微生物安全性评价，包括无菌实验和支原体、细胞内外源致病因子、内毒素的检测。其目的是判定干细胞产品满足无真菌、细菌、支原体、病毒及微生物代谢产物污染的质量要求，可采用体外细胞模型、敏感动物接种及鸡胚接种等方法进行检测。
3. 生物学安全性评价，包括异常免疫反应、异常分化、异位迁移停留、成瘤性/致瘤性/促瘤性检测等。其目的是为了排除细胞的内在生物学特性或外来因素引起的继发性生物学特性改变所导致的生物学安全问题。
4. 生物学有效性评价，包括诱导分化能力、免疫调控能力及组织再生功能等检测。值得注意的是，对于干细胞产品的生物学有效性评价，需根据临床适应证、给药途径、剂量等与临床治疗相关的因素，结合体外细胞模型和体内动物模型进行综合评估。
5. 其他还有诸如对制备中所使用的培养基及其他添加成分残余量的检验等。
（三）放行检验
干细胞制剂的放行检验是在完成质量检测的基础上，对每一类型每一批次干细胞制剂，在冻存入库及临床应用前所进行的相对快速简化检测，目的在于快速验证细胞质量，排除细胞制备操作中的污染风险，从而保证其干细胞制剂临床应用的安全性。开展放行检验，对于规范干细胞制剂的质量控制及临床应用不可或缺，能减少基于细胞疗法的临床不良事件，保障干细胞疗法的安全性。鉴于干细胞制剂的特殊性，放行检验应在相对短的时间内完成，以确保干细胞制剂入库或临床应用的时效性。
放行检验主要检测制剂的细胞属性和微生物安全性，检测项目包括：细胞计数和存活率检测，无菌实验、支原体检验、内毒素检验。为满足放行检验需尽量缩短检测时间的要求，上述检测项目应不断开展并应用快速稳定的检测方法，并同时采用标准方法进行比较验证。快速放行检验结果符合相关规定后可对细胞进行放行。
（ 四）复核检验
复核检验是由制备单位内部或第三方开展的样本溯源或质量复核检测。
1. 内部复核
在初次样本检测无效或需进行溯源的情况下，需对干细胞制剂的留样样本进行复核检测。除细胞活率外，复核留样样本数和类型与放行检验一致。进行复核检验的项目根据初次检测结果确定。
2. 第三方复核
由专业细胞检验机构/实验室进行干细胞制剂的质量复核检验，并出具检验报告，证明本机构/实验室生产的干细胞制剂符合临床使用要求。根据2015年原国家卫生计生委、国家食品药品监管总局联合发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》，为便于质量复核，项目申请者应向质量复核单位提供临床前干细胞制剂研究的综合报告，报告内容包括详细的干细胞制剂制备工艺、治疗适应证、所用辅料、包材，以及制备工艺各环节的质量标准。
二、干细胞产品质量评价的发展瓶颈
当前我国干细胞产业在国家鼓励性政策的引导下正蓬勃发展。虽然目前多家单位和企业已建立了临床级干细胞的质量检测体系，但由于干细胞产品种类众多，其临床应用的差异化个性化诉求对干细胞产品的质量评价体系和机构建设提出了更高的要求，干细胞产品质量评价的发展仍面临瓶颈：
第一， 针对干细胞的体内药代动力学监测技术难度较大，评估干细胞治疗的安全性和有效性的关键质量属性仍需要进一步明确。
第二，不同企业的制备工艺以及不同种类干细胞产品的制备方法各不相同，干细胞产品尚缺乏相对统一的质量检测方法和标准。
第三，有限的临床前研究数据对于干细胞临床应用的指导性不强，而干细胞临床研究也都处于较早期阶段，病例数有限，细胞使用方案还存在较大差异，因此临床治疗用干细胞产品的质量评估内容和标准较难统一。
由此可见，干细胞制剂的质量评价规范体系、内容和标准亟待在全行业的共同努力下加速推进完善。
三、同济大学附属东方医院对干细胞产品质量
评价的实践探索
同济大学附属东方医院作为国家干细胞临床研究备案机构和备案项目依托单位，展开了针对干细胞基础科研、制剂制备及临床治疗全流程的实践探索，力求推动干细胞制剂质量评价的标准化规范化：
第一，通过应用活体三维多模式成像示踪系统示踪干细胞移植后在动物体内存活、迁移、分布与功能整合的命运演变；并研发构建双模态造影剂，利用纳米金和磁性材料实现了干细胞体内MRI和光声成像，研究干细胞移植后在动物体内的命运演变，为有效解决干细胞体内药代动力学监测的难点问题开发创新技术。
第二，率先运用3D-低氧规模化扩增系统进行间充质干细胞大规模扩增，在制备环节执行全自动标准化流程，推进干细胞制备方法统一性和制备工艺的稳定性；建立了稳定的诱导多能干细胞培养体系，建成100多例覆盖中国60%人群的HLA高配型的诱导多能干细胞库，开发多能干细胞定向诱导实验体系，使原本定制化的产品有望成为通用性的“off-the-shelf product”，促进诱导多能干细胞产品制备工艺的统一。
第三，鼓励开展干细胞治疗的基础研究、临床前研究和临床研究，仅2020年即获批国家重点研发计划“干细胞及转化研究”重大专项3项，全院共4项干细胞临床研究项目获国家卫生健康委审批备案，开展了1项科技部应急项目，开展干细胞资源的社会共享，在干细胞产业领域的“全链条”贯通过程中已积累了丰富的实践经验；已联合中国整形美容协会发布《干细胞制剂制备与质检行业标准( 试行)》，并参与多项涉及干细胞制备、质量检验及临床研究的专家指导意见及行业标准起草，从而为促进干细胞产品的质量控制方法和评估标准的建立贡献了自主探索的成果，为干细胞产品的临床应用研究提供依据。
随着干细胞行业的加速发展，临床级干细胞的质量评价任务依旧艰巨，要用科学严谨的态度积极探索，用发展开拓的行动实践创新，不断加速干细胞质量评价新技术、新规范、新标准的开发，为全行业的快速良性发展注入了强劲动力。
（ID ：yxckbsc2021040301）
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