分子伴侣介导的自噬维持造血干细胞的功能
撰文│杨红梅
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
【据《Nature》2021 年3 月报道】：分子伴侣介导的自噬维持造血干细胞的功能（作者Ana Maria Cuervo 等）
哺乳动物体内的血细胞都是由造血干细胞（HSCs）产生，HSCs具有广泛的自我更新和多向分化能力。生理状态下，大部分HSCs都处于静止状态，但在大量失血或骨髓移植情况下，HSCs会迅速被激活，进入细胞周期进行自我更新或分化，补充体内的血细胞。HSCs 的激活需要很多分子和代谢调控，但HSCs激活后调控细胞重编码及随后HSCs恢复到静止状态的机制尚未完全阐明。美国阿尔伯特爱因斯坦医学院发育与分子生物学系的Ana Maria Cuervo和Britta Will 实验室合作发现分子伴侣介导的自噬可维持HSCs的功能，该成果发表在2021年3月的Nature 上。
随着年龄增长，HSCs自我更新和多谱系再生能力减弱， 这是由于活性氧（ROS）水平升高、DNA损伤及蛋白质沉积减少所致。该研究探讨了CMA对HSCs功能维持的作用。CMA是一种溶酶体选择性降解蛋白的形式，通过分子伴侣蛋白HSC70帮助目标蛋白折叠，经溶酶体受体LAMP2A识别蛋白中KFERQ序列，并将蛋白输入溶酶体贮存降解。CMA可被各种应激如氧化应激或DNA损伤等上调，其活性随年龄增长和代谢紊乱等下降。CMA在蛋白质量控制和细胞功能调节中的双重作用促使作者课题组推测其可能参与了HSCs功能的调节。
课题组首先构建了表达CMA 报告基因的小鼠KFERQDendra2，结果发现与年轻小鼠相比，老年小鼠细胞中CMA活性降低，且具有CMA活性的HSCs比例也较低。老年小鼠HSCs中LAMP2A水平降低， 而缺乏LAMP2A的细胞不足以产生CMA。随着年龄增长，人类CMA也可能会降低。作者课题组就发现随着年龄增长，人类HSCs中带有CMA靶向序列的蛋白质丰度更高，使用骨髓细胞清除剂5-氟尿嘧啶（5-FU）激活HSCs，CMA进一步上调，表明CMA在激活的HSCs中可上调。随后作者课题组构建了L2AKO小鼠，选择性清除了造血细胞的CMA，与稳态对照组小鼠相比，L2AKO小鼠中富集的干细胞（Lin-SCA1+cKIT+，LSK）和严格定义的表型HSCs（Lin-SCA1+cKIT+CD150+CD48-）群的数量更低，使用5-FU进行骨髓细胞清除后，两组的差异更明显。此外，作者课题组采用一种更慢性的HSCs激活模式，即连续移植和竞争性骨髓再生，发现与对照组相比，二次骨髓移植后所有外周血系的重建持续减少，表明功能性干细胞丢失。体外实验也显示L2AKO HSCs 的自我更新能力受损。综上，研究人员确定了CMA在稳态和激活状态下对维持HSCs的功能必要性。
L2AKO HSCs中骨髓再生减少，部分是由HSCs循环延迟所致，对照组恢复静止后，L2AKO HSCs仍持续循环。与对照组相比，5-FU激活HSCs后，L2AKO HSCs中ATP水平更低，ROS水平更高，这损害了HSCs的自我更新。尽管巨噬细胞被阻断时HSCs中ROS水平也会升高，但L2AKO HSCs中巨噬细胞通量、转录程序和自噬相关部位并没有变化，提示低能量状态和ROS水平升高可能是L2AKO HSCs 循环延迟和自我更新能力受损的原因。为了对结果进行进一步验证，研究人员鉴定出对照组和L2AKO HSCs在稳态下有405个基因，激活过程中有855个基因差异表达，且有308个蛋白作为潜在的CMA的底物，激活后这些蛋白在L2AKO细胞中积累，激活后对照组和L2AKO HSCs之间的酶含量差异只发生在蛋白水平而非转录水平，表明CMA可能促进其在激活过程中直接降解以适应代谢。综上，缺乏CMA会损害HSCs的激活。
代谢组学分析显示，L2AKO HSCs的糖酵解和葡萄糖-丙氨酸通路受损，而这些通路对稳态下HSCs的静止至关重要。研究人员证实阻断CMA后糖酵解减少为干细胞特有，稳态下L2AKO HSCs中CMA的底物GAPDH和PK的酶活性较低，且蛋白质沉积丢失，羰基化多肽、氧化蛋白和蛋白内含物水平更高；激活后，L2AKO LSK细胞的糖酵解仍然减少，但与对照组最显著的代谢差异是亚油酸代谢、脂肪酸合成和β-氧化。激活后，对照组的LSK细胞中亚油酸和α-亚麻酸代谢通量上调， 而L2AKO LSK细胞中并没有。FADS2是亚油酸代谢的限速酶，抑制FADS2可降低对照组的自我更新能力；而加入FADS2 的直接产物GLA可恢复L2AKO HSCs的自我更新，表明亚油酸和α-亚麻酸代谢阻断是细胞功能丧失的原因。激活后，对照组和L2AKO LSK细胞中FADS2水平均增加，作者所在课题组研究了FADS2翻译后修饰的差异，发现存在乙酰化程度更高的趋势。L2AKO LSK细胞的蛋白乙酰化程度高，而L2AKO HSCs和老年HSCs中积累的蛋白通常参与细胞代谢包括脂质代谢。研究人员认为，乙酰化触发CMA去除失活的FADS2，并通过改变活性酶与失活酶的比例，在HSCs激活过程中，CMA正向调节FADS2活性，增加脂肪酸代谢。综上表明，CMA调节HSCs的脂质代谢。如果亚油酸代谢未能上调，随后线粒体脂肪酸β-氧化和ATP水平降低，激活的L2AKO HSCs自我更新就会减少。
缺乏CMA的年轻L2AKO HSCs，部分显示了老年HSCs的蛋白组变化。老年HSCs中积累的蛋白，有一半在年轻L2AKO HSCs中也升高；老年HSCs显示糖酵解和游离脂肪酸代谢发生变化，与年轻L2AKO HSCs一致，GLA/亚油酸的比例低，Lys42位点的FADS2乙酰化水平升高。老年小鼠体内补充GLA提高了HSCs的功能，体外补充GLA也增加了长期培养的功能性人体干细胞的数量。这些发现支持亚油酸和α-亚麻脂肪酸代谢障碍导致的衰老中HSCs功能的丧失，并强调了与衰老和缺乏CMA的年轻L2AKO HSCs机制类似。随着年龄增长，老年L2AKO小鼠的表型HSCs减少，HSCs再生能力进一步降低，ROS水平明显增加，表明缺乏CMA时的功能性HSCs消耗随年龄增长进一步加重。作者所在课题组进而构建了hL2AOE 小鼠，以保留老年小鼠HSCs的CMA通量，防止低活性CMA的HSCs群出现，结果进一步证实了在老年小鼠中预防CMA衰退可保护HSCs的功能，较好的蛋白稳态和保留葡萄糖和脂肪酸代谢可能是其功能改善的原因。说明遗传激活CMA可改善老年小鼠HSCs的功能。因此，在已衰老的HSCs中上调CMA是一种改善其功能的可行干预措施。口服CMA激动剂（CA），体内激活老年小鼠HSCs的CMA，可降低氧化蛋白水平，恢复GAPDH活性并增加糖酵解通量，有助于改善HSCs的功能。此外，在59岁以上老年捐赠者的CD34+人造血干/祖细胞（HSPCs）中添加CA，显著增加了HSPCs 的数量，并在长期培养后维持细胞输出，表明药理激活的CMA也可改善老年人HSCs的功能。综上，恢复CMA可使衰老的HSCs恢复活力。
本研究证明CMA可维持成年小鼠HSCs的功能，是干细胞中蛋白质量控制和HSCs激活后脂肪酸代谢上调所必需。CMA还通过调节FADS2依赖的脂肪酸代谢以适应HSCs分裂的代谢需要。缺乏CMA的L2AKO HSCs的表型模拟了老年人的HSCs。HSCs的CMA活性随年龄增长而降低，证明遗传或药理激活CMA可恢复老年小鼠和老年人HSCs的功能。研究揭示了CMA在质量控制、能量需求以及HSCs长期功能维持中具有重要调控作用，对提高老年人HSCs功能和骨髓移植有重要的临床意义。提示CMA可能是在诸如衰老或干细胞移植等情况下增强HSCs功能的一个潜在的有效治疗靶点。
（ID ：yxckbsc2021040602)
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