新一代间充质干细胞及其外泌体治疗急性心肌梗死的研究进展
撰文│杨跃进
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
一、自体骨髓干细胞治疗AMI的优势和缺陷
急性心肌梗死（AMI）再灌注治疗包括急诊冠状动脉介入（PCI）和溶栓治疗，能够挽救缺血和损伤的心肌，缩小梗死（MI）面积， 明显改善患者的心功能和近远期预后；但对坏死的心肌仍无法挽救且不能再生，大面积MI可出现心室重塑，心功能进行性降低， 最终导致慢性心力衰竭，5年生存率通常低于50%。
自2002年，Strauer报道首个国际干细胞临床研究以来，临床用于治疗AMI的干细胞仍然是自体骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs），包括单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。其中， 自体骨髓MSCs因其取材方便、培养技术成熟、体外扩增能力强、可自体移植、异体移植无免疫排斥反应、无伦理争议，以及具有免疫调节功能等众多优势成为心肌再生治疗的优选种子。大量临床研究显示BMSCs治疗AMI均有效，但疗效甚微，仅能提高左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）3%～5%，主要通过旁分泌机制，并无心肌再生作用。国际研究发现干细胞的旁分泌机制通过其外泌体（exosome）介导，后者为直径30～150nm的细胞外囊泡结构，包含多种功能调节蛋白因子、mRNA和非编码RNA等，其通过传递功能分子， 在细胞间信号传导和功能调节方面发挥重要作用。外泌体移植治疗AMI具有与干细胞移植相似效果， 还有无致瘤风险、无免疫原性、性质稳定、方便运输及输注等突出优点。特别是无免疫原性， 也使异体MSCs的外泌体成为最具潜力的治疗AMI的新一代生物药物，可免去等待自体MSCs所需3～4周的培养扩增时间，但遗憾的是对MI后心功能改善效果与MSCs一样很微弱。
二、新一代MSCs及其外泌体治疗AMI的进展与突破
国际研究已经公认，干细胞移植治疗AMI疗效不佳的原因主要是移植干细胞由于恶劣的炎症环境而存活率较低，另一方面，移植干细胞不能靶向迁移，归巢到MI区的数量很有限。因此，如何使更多移植的干细胞靶向归巢到MI区并存活下来是解决问题的关键。笔者研究团队针对这一国际难题，提出了“土壤- 种子”假说，一方面改善“土壤”（炎症微环境），减少移植干细胞死亡；另一方面是优化“种子”，即改良干细胞，使其具有抗凋亡和靶向归巢作用，大幅增加其移植后归巢至MI区的数量和生存率, 增强修复能力，提高心功能。
早期研究依据他汀类降脂药具有抗炎、抗凋亡、抗氧化应激和保护内皮功能的多效性（pleiotropic effects）， 用于改善“土壤”，通过猪AMI模型表明口服大剂量阿托伐他汀（ATV）60～80mg/d可减少移植的MSCs凋亡，提高其存活率，使LVEF提高7.2%，机制与其抗炎和抗氧化应激有关，也与激活RhoA/ROCK/ERK通路相关。临床研究也显示服用大剂量ATV一周， 能使大面积前壁AMI恢复期冠脉内移植自体骨髓MSCs后1年的LVEF中位数提高12.6%（ 从31.6%～47.5%），显著高于常规剂量他汀的5%（ 从32.5%～38%, P=0.001）， 并伴有NT-ProBNP显著降低（215.8pg/ml vs 906.6pg/ml，P=0.005）和同位素正电子发射断层显像即PET的瘢痕面积缩小（-3.13% vs +3.06%，P=0.026），显示了AMI干细胞治疗中改善“土壤”的有效性和必要性。
优化“ 种子” 方面， 使用1μmol/L阿托伐他汀溶液对MSCs进行预处理24小时，不仅能抗凋亡，还能使MSCs膜受体G 蛋白耦合受体4（CXCR4）从膜内外翻，由MI区基质细胞衍生因子1（SDF-1）趋化，促进移植干细胞靶向归巢至MI区（SDF-1/CXCR4 轴）， 形成了新一代MSCs，从大鼠尾静脉输入显著提高干细胞归巢率和存活率，使LVEF提高17.5%， 梗死面积缩小50%。口服强化他汀联合他汀预处理的MSCs移植治疗急性心梗可使LVEF增加15.8%（从51.2%～67.0%），梗死面积缩小>50%， 还发现口服强化阿托伐他汀能够使梗死区SDF-1表达峰值从AMI 后1天延迟至第7天，促进干细胞的持续归巢和存活率来改善心功能。
干细胞移植的最佳时间窗及移植次数是临床的必答题。前者与MI区炎症环境的恶劣程度及其心肌SDF-1分泌水平之间的动态平衡相关。过早移植，即在心肌梗死后3天内给予干细胞移植，由于MI区心肌SDF-1表达高峰， 干细胞归巢的增加而被广泛应用。然而，同期MI区恶劣的炎症微环境并不利于归巢的干细胞生存， 这也是临床疗效有限的原因之一。相反，晚期移植，即在心肌梗死之后3～4周给予干细胞移植， 对危重患者虽更安全，MI区炎症也已基本消退；但MI心肌分泌的SDF-1水平已很低；而且此时心室重塑已不可逆， 瘢痕形成阻碍干细胞的定植， 已基本被国际临床研究结果否定。移植次数与治疗效果的关系也是干细胞治疗领域一个备受关注的方面。多数研究均证实对于不同移植途径（静脉移植、心肌内注射等），多次移植较单次移植治疗效果更好。
因此， 在他汀改善“ 土壤”基础上，本团队进一步评价了新一代他汀预处理MSCs在AMI不同时期（ 早期、中期、晚期） 单次、2次、3次移植对提高心功能的影响。早期为MI后第1周， 中期为第2周，晚期为第4周。口服强化ATV在AMI后4周过程中均使MI 周边区SDF-1分泌显著升高，表达高峰从AMI后1天推迟至1周，第2周仍处于较高水平，甚至到第3周和第4周时，SDF-1的表达量仍然是AMI对照组的3.3 倍。最佳移植时间窗是AMI后第2周（中期），三次移植在归巢定植、抗炎抗凋亡、血管新生、血流动力学改善、心功能提高和MI面积缩小等方面均显示较单次产生明显的累积效应，移植疗效最佳。中期三次移植归巢率最高， 达到23.96%，LVEF值较AMI对照组升高16.2%，MI面积则从AMI组的49.8% 降至16.1%，效果突出。机制主要与新一代MSCs更高的归巢和存活率、更强的抗炎抗凋亡和更多的血管新生等有关，而早期和晚期单次移植归巢率均最低约为4%。
鉴于干细胞治疗作用是通过旁分泌机制而实现，干细胞来源的外泌体则是旁分泌的载体。国际研究已证明MSCs来源外泌体具有MSCs本身相同的效果。笔者研究团队对新一代MSCs（经他汀预处理的MSCs）产生的外泌体进行了实验探索，MI区心肌内注射移植新一代MSCs的外泌体，能使大鼠心肌梗死4周后的LVEF突破性提高了27%，机制是通过上调了长链非编码RNA（lncRNA）H19，促进血管再生并进一步保护心肌而起作用。笔者团队还探索了外泌体与干细胞联合移植，假设协同作用能获得更好的治疗效果。先在心肌梗死后30min 心肌内注射移植经荧光标记外泌体示踪其分布，发现在术后第1 天、第3天和第7天均可见其在MI周边区分布，但第3 天的滞留量已显著降低，为第一天的51.03%，至第7天时，进一步降至23.38%。进一步对比了心肌梗死后30min 移植外泌体联合心肌梗死后第1、第3或第7天联合移植新一代MSCs的治疗效果。结果表明：联合移植组均能显著提高心功能，其中心肌梗死后第3天联合移植组改善效果最为明显，与AMI对照组对比，将LVEF提高约27.91%，梗死面积由AMI 组的37.58 % 缩小至18.48%。研究结果提示，通过AMI当天先移植心肌内注射外泌体可有效改善急性期心肌梗死微环境，使AMI后3天时梗死周边区炎症反应明显消退，处于相对较低的状态，而此时SDF-1 水平仍然在高峰期，移植经ATV预处理的高表达CXCR4的新一代MSCs，不仅能提高干细胞归巢率，并且为MSCs的存活提供更加有利的微环境，达到显著提高心肌梗死后心功能、缩小梗死面积的效果。
三、对新一代异体骨髓MSCs及其外泌体展望
在他汀改善“土壤”即MI区炎症的恶劣微环境，并使用他汀预处理的新一代骨髓MSCs及其外泌体“种子”移植，能使治疗AMI的效果突破性提高后，从临床转化或需求角度看，自体MSCs的突出问题是需要体外培养2～3周，大大影响了临床AMI患者急救的可及性和老龄患者的可获得性。基于骨髓MSCs本身的免疫调节和抑制作用，尤其是外泌体几乎无免疫原性的特性，新一代异体骨髓MSCs及其外泌体的临床转化研究是唯一的解决方案。这一点目前已经超越“曙光初现”阶段，下一步应该加速临床前研究，争取尽早进入临床试验阶段，尽快解决骨髓干细胞治疗AMI 疗效微弱的国际难题，既可为AMI救治、预防心力衰竭提供有力武器，更能支持我国在生物制药产业上实现弯道超车，在国际上处于领跑地位。
（ ID：yxckbsc2022030101）
作者简介
杨跃进 主任医师
主任医师，博士研究生导师，国家心血管病中心原副主任，中国医学科学院阜外医院原副院长，心内科和冠心病中心原主任，现任北京协和医学院长聘教授。长期从事提高骨髓间充质干细胞（MSCs）及其外泌体治疗急性心肌梗死（AMI）效果及机制探索研究。针对骨髓干细胞移植治疗AM临床疗效低下的国际瓶颈难题，原创提出“土壤”与“种子”假说基础上，通过他汀改善炎症微环境，以利于MSCs的存活（Eur Heart J 2008 ），同时用他汀预处理干细胞增加其存活与归巢（Am J Transl Res 2015）， 不断提出移植方案的优化（Stem Cells Transl Med 2019 ），并对MSCs 来源的外泌体移植治疗的机制（Cardiovasc Res 2020）及移植方案（Stem Cell Res Ther 2019）展开深入研究，取得重要进展并有所突破。
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