文献学习5 | 传统抗凝治疗能否解决凝血新机制NETs
导语：微血栓形成是导致ECMO相关凝血功能紊乱的重要机制，但目前以肝素为核心的抗凝方案对于微血栓的抑制作用并不理想。中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是近年来研究新发现的免疫血栓重要启动物，且高表达于ECMO支持的患者中。为了探明肝素对NETs是否具有抑制作用，回顾两篇文献显示：肝素能够裂解NETs，但无法抑制NETs裂解产物（细胞外DNA、组蛋白和Cat G）的致凝作用。这提示肝素用于ECMO抗凝可能是存在缺陷的，NETs可成为抗凝方案的新靶点。
ECMO相关凝血紊乱：亚临床微血栓更值得关注
2014 ELSO Anticoagulation Guideline
当前肝素治疗可能存在“盲点”
尸检研究显示ECMO引起大量肺内亚临床微血栓[1]
19VA +1 VV。100%出现临床与尸检不符；56.6%发现心梗、颅内出血[2]
[1] Chest. 2018 Apr;153(4):825-833
[2] Cardiovasc Pathol. 2019 Jul - Aug;41:24-28.
研究背景——NET
NETs（ neutrophil extracellular traps，中性粒细胞胞外陷阱）是中性粒细胞释放至胞外的核物质组成，包括胞外DNA 和颗粒蛋白
蛋白成分：组蛋白（占70%）、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、髓过氧化酶等
最初发现功能——捕获、包裹细菌，非特异性杀菌机制
新近研究进展——Immunothrombosis[1]
[1] Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 2019, 45(01), 86-93
NETs促凝的机制
①依赖血小板途径：结构完整的NETs为血小板黏附和聚集提供附着点，进而成为后期血栓的提供反应平台。
②非依赖血小板途径：NETs可以直接激活内源性凝血途径。
③NETs内的多种组分（细胞外DNA、组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白
酶、组织蛋白酶G、髓过氧物酶）均能促进凝血、激活血小板。
NETs与ECMO相关血栓
[1] Perfusion, 2018, 34(3), 211-216
[2] Anesthesiology Research and Practice, 2016, 2016, 1-11
问题
肝素能否抑制NETs？
NETs能否解释目前肝素的缺点？
肝素能去除NETs
既往研究发现，肝素能够使NETs数量减少，观察到其被裂解为组蛋白、胞外DNA[1,2]
但，这就够了吗？
[1] British Journal of Haematology, 2017.
[2] Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010.
Blood, 2017, 129(8), 1021-1029
方法
暴露因素：
DNA（from isolated human neutrophils ）
Recombinant human histones H3 or H4
研究对象：
PFP（无血小板血浆）、PRP（富血小板血浆）
结局：
Thrombin generation
DNA对凝血因子影响＞PLT
A：无血小板血浆（Platelet free plasma）
B：富血小板血浆（Platelet rich plasma）
DNA激活内源性凝血途径
组蛋白可激活PRP
组蛋白不能激活PFP[1]，data not shown
[1] Blood. 2011;118(7):1952-1961
瓜氨酸化组蛋白激活PRP
完整NETs不能激活PFP或PRP
裂解NETs产生的DNA可以激活PFP＞PRP
小结
完整NETs促凝作用弱
NETs裂解产物具有强促凝作用
–细胞外DNA：通过内源性凝血途径
–组蛋白：通过激活血小板
既往研究：肝素具有裂解NETs的作用
Cell Communication and Signaling, 2018，IF: 5.3
方法
暴露因素：Cell-free NETs （stimulated from isolated human neutrophils ）
研究对象： washed human platelets
结局：
–platelet aggregation,
–dense granule secretion
–procoagulant phosphatidyl serine exposure
NETs directly induce aggregation of washed human platelets.
NETs stimulate Platelet secretion
NETs刺激PLT标记激活标志物表达
NETs刺激PLT细胞膜PS外翻
肝素不能抑制NETs的聚集PLT作用
组蛋白是NETs裂解产物
组蛋白是促凝物
肝素作用：①裂解NETs，②结合组蛋白 [1]
[1] PNAS. 2010;107:15880–5
DNase不能抑制NETs的聚集PLT作用
DNase can dismantle NET-DNA
肝素能去除NETs
总结
肝素虽可以裂解NETs，但不能抑制NETs促凝作用，甚至增加其促凝作用
类似研究：DNase-treatment of NETs resulted in increased coagulation effect[1]
ECMO相关血栓、DIC检测: 不能止步于NETs，更应关注其解体产物
[1] Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34:1977–84
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