科研丨天津环保所: 宏基因组分析发现牛粪同时重塑蚯蚓肠道中的抗生素和金属抗性基因组(国人佳作)

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编译：微科盟前路漫漫，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

蚯蚓转化是一种生态友好的生物过程，可将牲畜粪便转化为良性营养丰富的有机肥料。然而，关于蚯蚓转化的牲畜粪便对蚯蚓肠道微生物群中抗生素抗性基因组的影响知之甚少。本研究进行了实验室规模的蚯蚓堆肥，通过宏基因组分析全面评估了蚯蚓以牛粪(CM)为食时肠道中抗生素抗性基因(ARGs)的变化。同时评估了铜(Cu)作为食品添加剂的作用。CM显著增加了前肠和中肠中的抗生素抗性基因组，而减少了后肠中的抗生素抗性基因组。在金属抗性基因(MRGs)中也观察到了类似的趋势。值得注意的是，CM中的Cu对蚯蚓肠道中ARGs和MRGs的组成影响不大。CM改变的蚯蚓肠道微生物组是ARGs和MRGs转变的主要原因。在蚯蚓粪便中，Cu (100和300 mg/kg)显著增加了ARGs和MRGs的丰度。本研究为蚯蚓肠道中ARGs和MRGs对CM的响应提供了有价值的见解，并强调了在畜禽养殖中合理使用重金属作为饲料添加剂的必要性。

图文摘要

论文ID

原名：Cow manure simultaneously reshaped antibiotic and metal resistome in the earthworm gut tract by metagenomic analysis

译名：宏基因组分析发现牛粪同时重塑蚯蚓肠道中的抗生素和金属抗性基因组

期刊：Science of the Total Environment

IF：10.753

发表时间：2022.9.27

通讯作者：张克强

通讯作者单位：农业农村部环境保护科研监测所

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2022.159010

实验设计

本实验中使用的蚯蚓是赤子爱胜蚓，该蚯蚓广泛用于畜禽粪便的动物转化。首先饲喂腐烂果实30 d，以提高其对牛粪的适应能力。饲喂结束后收集不同肠段内容物并命名为E组。从奶牛场获得的牛粪自然堆放45天使其充分分解，以提高蚯蚓的适口性。分别饲喂蚯蚓牛粪(CK组)、牛粪+Cu 100 mg/kg(T1组)、牛粪+Cu 300 mg/kg(T2组)、牛粪+Cu 500 mg/kg(T3组)，CM为牛粪对照组。饲喂30 d后收集蚯蚓前肠、中肠、后肠内容物以及牛粪，宏基因组测序分析微生物、抗生素抗性基因(ARGs)和金属抗性基因(MGEs)。

图1 实验设计示意图。

结果与讨论

1 牛粪重塑蚯蚓肠道中ARG组成

为了研究CM对不同蚯蚓肠段ARG组成的影响，使用宏基因组测序检测在没有CM和存在CM消化的情况下蚯蚓肠道中的抗生素抗性基因组。在蚯蚓肠段中共鉴定出377种ARG亚型，划分为24种ARG类型。多重耐药基因(42.4%)和万古霉素(14.3%)是最常检测到的，其次是Macrolide-Lincosamide-Streptogramin (MLS, 8.7%)、四环素(8.6%)和氨基糖苷(7.7%)。我们的研究结果表明，喂食CM重塑了蚯蚓肠段中的ARGs组成，ARGs在蚯蚓的前肠和中肠均增加，而在蚯蚓的后肠减少。与不含CM组的蚯蚓相比，CM消化后ARG总丰度在前肠增加28.9%，在中肠增加30.2%，而在后肠减少53.7%(图2a)。从ARG多样性来看，摄入CM后前肠(ARG数为155)和中肠(ARG数量为168)观察到更多数量的ARG，而在后肠中观察到较少数量的ARG(ARG数为143)(图2a)。值得注意的是，将铜添加到CM中时，蚯蚓肠道中的ARGs丰度没有受到影响。与无Cu组(CK)相比，前肠ARG总丰度下降0.7%±4.7%，中肠下降3.4%±2.6%，后肠下降3.5%±39.2%，表明Cu对蚯蚓肠段中ARG丰度的影响有限。基于Bray-Curtis距离的PCoA进一步证实了消化CM时蚯蚓肠段中ARG组成的变化。PCoA显示肠段中的原始ARG组成与喂食CM的组分离(图2b)，并且有Cu组与无Cu组聚集在一起，对于前肠、中肠和后肠都一样。CM中含有多种微生物和营养物质，两者都可以改变抗生素耐药性组成。这些结果表明，CM(而非Cu)重塑了蚯蚓肠段中的ARGs组成。

图2 蚯蚓肠道和牛粪中的ARG谱。(a)蚯蚓肠道中的ARG丰度。(b)PCoA分析描绘了不同摄食组蚯蚓肠道中的ARGs组成。缩写：FG，前肠；MG，中肠；HG，后肠；CM，牛粪。各种处理组缩写参考图1。
2 牛粪对蚯蚓肠道中MRG组成的影响考虑到金属可能通过共同选择ARGs和金属抗性基因(MRGs)来促进抗生素抗性的扩散，我们进一步追踪了蚯蚓将含铜的CM转化后肠道中MRG的变化。值得注意的是，我们发现MRG的变化显示出与ARG相似的趋势。在我们的研究中，蚯蚓肠道中检测到308个MRG亚型，属于16个MRG类型(图3a)。消化CM后蚯蚓肠段的MRG组成在所有处理中都发生了重塑。具体而言，前肠(15.7%)和中肠(20.6%)的MRG丰度均增加，但后肠(65.8%)MRG丰度显著降低。Cu对前肠(-2.8%)、中肠(-1.1%)和后肠(3.7%)的MRG变化影响不大，表明牛粪(而非Cu)在蚯蚓肠段中MRG的再分布中起关键作用。
3 蚯蚓肠道中ARGs和MRGs的共现模式由于在蚯蚓肠道中观察到ARGs和MRGs的变化，我们假设ARGs和MRGs的变化之间存在联系。为了测试ARGs和MRGs的同步变化，进行了线性回归分析，结果表明ARGs和MRGs的总丰度之间存在显着正相关关系(p < 0.05，r = 0.68)(图3b)。此外，Procrustes检验显示ARGs和MRGs的组成之间存在显着相关性(M2 = 0.15，r = 0.92，p = 0.001)(图 4a)。这些结果表明，CM同时影响蚯蚓肠道中的ARG和MRG。

采用Spearman相关性的网络分析(r > 0.8，p < 0.01)以识别蚯蚓肠道中ARGs和MRGs的共现模式(图4b)。共观察到49个ARGs与MRGs相关，其中20个ARG亚型为多药耐药基因，包括mdtC、acrB、mexA、mexB、mexD、mexF、bpeF、ceoB、oprC、oprM等，占据了共现模式中大多数ARG亚型，这表明铜暴露后多重耐药基因和金属抗性基因的共选择。此外，多重耐药基因常与铜或多金属抗性基因相关，如copA、copB、copR、czcA、czrA、acrD、cueA等，共观察到32个具有铜抗性和多金属抗性基因与多重耐药基因相关。值得注意的是，在本研究中，多重耐药或金属/多金属抗性基因是对Cu的响应中富集最多的基因。这些发现表明多重耐药与铜或多金属抗性的共同出现可能是响应CM消化的关键因素。先前的研究指出ARGs和MRGs的共现可以为他们的共选择潜力提供新的见解。本研究中显示的蚯蚓肠道中ARGs和MRGs的共现暗示可能的共选择。以前的研究已经记录了不同金属对ARGs的选择，包括交叉抗性(抗生素和金属具有相同的抗性决定因素)和共同抗性(多个抗性决定因素以相同的顺序存在)。例如，已在副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的染色体中观察到多重耐药基因(mexA、mexB)与铜抗性基因(copA、czcA)的物理联系。此外，在当前研究中鉴定了外排介导的MRGs和ARGs，包括mexB、oprM、mdtC和acrB等，表明ARG选择的潜在交叉抗性。在当前的研究中，多重耐药基因与铜抗性基因共存可能表明蚯蚓肠道中发生了共同抗性或交叉抗性，导致消化CM后ARGs和MRGs同时发生变化。

图3 蚯蚓肠道和牛粪中的MRG特征。(a)蚯蚓肠道中的MRG丰度。(b)ARG丰度与MRG丰度的相关性分析。斯皮尔曼r = 0.68, p = 0.0015。缩写：FG，前肠；MG，中肠；HG，后肠；CM，牛粪。
图4 蚯蚓肠道中ARGs和MRGs的相关性。(a) Procrustes检验显示ARGs和MRGs显著相关。(b)网络分析显示ARGs和MRGs在蚯蚓肠道中同时出现。ARGs与细菌宿主之间的连接代表显著的Spearman相关性。
4 牛粪改变了蚯蚓肠道细菌群落，从而改变了抗生素和金属抗性基因组研究了喂养CM对蚯蚓肠道微生物的影响，我们发现所有蚯蚓肠段中放线菌门的丰度均大幅下降，而变形菌门、厚壁菌门和绿弯菌门均增加(图5a)。特别是绿弯菌门的富集最为明显，前肠、中肠和后肠分别增加了25.2倍、95.8倍和199.7倍。PCoA结果显示未饲喂CM的蚯蚓肠段与饲喂CM的蚯蚓肠段细菌群落明显分离(Adonis检验，R² = 0.176, p = 0.047，图5b)。此前的一项研究揭示了蚯蚓体内三个肠段的细菌群落分布，然而，据我们所知，这是第一个证明喂食CM会显著改变蚯蚓肠段细菌群落分布的研究，为蚯蚓转化CM提供了新的见解。CM含有多种细菌和营养丰富的有机物，这两种特性都对通过外源性细菌定植和肠道本土增殖形成的肠道菌群产生巨大影响。值得注意的是，先前的研究发现包括总氮、水溶性有机物、亚硝酸盐、铵和铁在内的物质在前肠的丰度最高，然后到后肠逐渐降低。CM中丰富的营养可能引起细菌增殖，从而改变抗生素和金属抗性基因组。然而，在蚯蚓肠道菌群转变中起关键作用的物质还需要进一步评估。

为了确定在抗生素和金属抗性基因的共选择中负责ARGs的细菌宿主，细菌群落与ARGs或MRGs的共现模式如图5所示。结果显示12个ARGs亚型编码对应5种抗生素抗性(氨基糖苷、多重耐药、β-内酰胺、四环素和万古霉素)，由放线菌门、厚壁菌门和变形菌门携带。放线菌门、厚壁菌门和变形菌门中可能存在21种MRGs亚型。在ARGs和MRGs的宿主细菌中，Mycolicibacterium hassiacum、Mycolicibacterium thermoresistibile、Rhodococcus sp_RD6_2、Clostridiumsp_Bc_iso_3、Herbinix hemicellulosilytica和Legionella londiniensis 6个物种作为ARGs和MRGs的宿主细菌(图5c和5d)，表明这些物种可能同时是ARGs和MRGs的宿主。其中，Rhodococcus sp_RD6_2是多种铜抗性基因(copR、cueA)和多重耐药基因(mexB、mexW)的潜在宿主细菌。属于放线菌门Mycolata组的红球菌属菌株可以在重金属胁迫和抗生素下存活。值得注意的是，Rhodococcus sp_RD6_2是蚯蚓中的优势物种，而在牛粪中检测不到，这意味着Rhodococcus sp_RD6_2丰度的变化归因于蚯蚓肠道微生物的变化，而不是蚯蚓肠道中外来细菌的存活。结果表明，Rhodococcus sp_RD6_2可能是CM和Cu暴露后蚯蚓肠道中ARGs和MRGs共现的关键物种，尤其是多重耐药和Cu/多金属抗性基因。

图5 蚯蚓肠道细菌群落概况。(a)蚯蚓肠道和牛粪中的细菌门分布。(b)PCoA分析描述了蚯蚓肠道细菌群落组成。网络分析揭示了(c)ARG亚型和微生物物种以及(d)MRG亚型和微生物种之间的共现关系。
5 铜仅对蚯蚓粪便中抗性组的积累施加选择性压力蚯蚓转化作为一种生态友好型生物处理方法已被证实可有效缓解牲畜粪便中特定ARGs的增殖，而我们的综合宏基因组分析显示，与CM相比，蚯蚓转化增加了蚯蚓粪便中22.4%的抗生素抗性基因组的总丰度，提供了蚯蚓消化CM过程中抗生素抗性基因组的全貌。值得注意的是，在蚯蚓肠道消化CM后，Cu以剂量依赖性方式进一步增强了蚯蚓粪便中ARG的积累。在低剂量100 mg/kg Cu (T1S)处理下，总ARG丰度增加了76.6%；中等剂量300mg /kg Cu (T2S)处理下，总ARG丰度增加了121.2%。其中，多重耐药基因在检测的ARGs中最为富集，在T1S和T2S中分别增加了105.9%和149.3%。相比之下，在高剂量铜暴露(500 mg/kg, T3S)下，与无铜处理相比，ARG丰度略下降3.9%(图6a)。除ARGs外，Cu对蚯蚓粪便中MRG的丰度有明显影响，且呈剂量依赖性。与未添加Cu的对照组相比，低剂量Cu (100 mg/kg)使总MRG丰度增加了40.0%，中剂量Cu (300 mg/kg)组的增加趋势进一步加剧为68.8%。在低剂量和中剂量的铜处理中，铜抗性基因分别增加了13.0%和54.7%(图6b)。值得注意的是，多金属抗性上升趋势最为明显，在低剂量和中剂量Cu处理中分别增加了99.1%和134.3%，表明多金属抗性基因对Cu暴露反应迅速。然而，500 mg/kg Cu导致MRG丰度略微增加1.2%，这表明500 mg/kg Cu足以抑制细菌增殖，即使对于金属抗性细菌也是如此。最后，确定了蚯蚓粪便中Cu的浓度。如表2所示，蚯蚓粪便中Cu的浓度与添加Cu的量有关。铜浓度在T3S中最高，为796.16±19.24 mg/kg，其次是T2S(538.91±15.15 mg/kg)、T1S(296.99±7.29 mg/kg)和CKS(96.24±5.75 mg/kg)。各组蚯蚓粪便中铜浓度均增加了1.59-2.97倍，表明蚯蚓转化后CM中的Cu残留在蚯蚓粪便中富集。这主要与蚯蚓转化后牛粪总量减少有关。先前的研究发现，土壤原生细菌的最小抑制浓度为500-800 mg/kg，这表明T3S中的蚯蚓粪便足够高以抑制细菌增殖，从而降低ARGs和MRGs的丰度。当CM中的Cu浓度低于500 mg/kg时，蚯蚓粪便中的Cu残留可以同时促进ARG和MRG的浓度。

蚯蚓转化牲畜废物被认为是一种很有前景的环保技术，可以将牲畜废物转化为蚯蚓粪便从而更有利于作物生长。特别是，之前的一项研究发现蚯蚓粪便显著降低了几种ARGs的丰度，这表明该技术有可能减轻牲畜粪便中的ARGs。然而，我们的研究结合宏基因组分析表明，蚯蚓转化牲畜粪便可以增加抗生素和金属抗性基因组。虽然一些基因的丰度会降低，但整体基因丰度呈现明显增加的趋势，特别是对于多重耐药和多金属抗性基因。宏基因组测序提供了一个全面的工具来呈现蚯蚓转化中抗性基因组的完整图像。同样，尽管通过qPCR发现了各种去污技术，如好氧堆肥和高级氧化可以减少一些ARGs，但这些技术对整体抗性基因组的影响还需要进一步探索。

图6 蚯蚓粪便中的ARG和MRG。牛粪中添加Cu后蚯蚓粪便中(a)ARG和(b)MRG丰度。CKS,以不含铜的牛粪为食的蚯蚓处理组的蚯蚓粪便；蚯蚓以牛粪中添加100 mg/kg Cu (T1S)、300 mg/kg Cu (T2S)和500 mg/kg Cu (T3S)为食消化30天后获得的蚯蚓粪便。
表1 蚯蚓粪便中Cu的浓度。(原表2)

缩写:CKS，蚯蚓粪便来自CK处理组不添加Cu；T1S，蚯蚓粪便来自T1处理组添加100 mg/kg Cu；T2S，蚯蚓粪便来自T2处理组添加300 mg/kg Cu；T3S，蚯蚓粪便来自T3处理组添加500 mg/kg Cu。

结论

本研究利用宏基因组分析，全面探讨了添加Cu的CM对蚯蚓肠段和蚯蚓粪便中ARGs和MRGs的影响。CM显著改变了蚯蚓前肠、中肠和后肠中抗生素抗性基因组的分布，表现为前肠和中肠的ARG丰度均增加，在后肠中丰度降低。在蚯蚓肠道中，MRG表现出与ARG相似的趋势，ARG和MRG的共现模式可以通过ARG和MRG的同步变动来解释。被CM改变的蚯蚓肠道微生物组是ARGs和MRGs变化的原因。值得注意的是，Cu仅在蚯蚓粪便中以剂量依赖性方式促进ARGs的积累，而在蚯蚓肠道中不促进。本研究为蚯蚓以含Cu的CM为食时肠道中抗生素抗性基因组的命运和行为提供了有价值的信息，阐明了蚯蚓转化牲畜粪便过程中可能的ARG增殖。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0048969722061095

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