科研丨J HAZARD MATER: 土壤微生物群落降解六溴环十二烷的宏基因组学研究(国人佳作)

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编译：微科盟LKJ，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

六溴环十二烷(HBCDs)是2013年《斯德哥尔摩公约》列出的全球普遍存在的持久性有机污染物(POPs)。从水体到植物，甚至在人体等多种环境介质中都能发现它们的存在。高度的生物累积特性使HBCDs构成了紧迫的公共卫生问题。本研究证明了台湾农业土壤中的原生微生物群落可以在没有额外碳源激励的情况下分解HBCDs。降解动力学在第一次处理后达到0.173/天，第二次处理后达到0.104/天。在增加碳源后，速率常数降至0.054–0.097/天。羟基脱溴代谢物和环裂解长链烷烃代谢物被鉴定为支持土壤微生物群落利用的潜在代谢途径。通过纳米孔测序建立的宏基因组显示，HBCD处理后土壤微生物群落的组成发生了显著变化。通过排序、比较相对丰度和进行网络分析，鉴定得到包括Herbaspirillum、Herbaspirillum、Brevundimonas、Azospirillum、Caulobacter和Microvirga在内的新型细菌类群，可以通过卤代/芳香化合物降解、谷胱甘肽-S-转移酶和水解酶活性帮助HBCD生物转化。本研究将宏基因组学研究、降解动力学和代谢组学策略相结合，提出了一种实用的方法，使我们能够破译HBCDs的自然衰减和修复机制。

图文摘要

论文ID

原名：A metagenomics study of hexabromocyclododecane degradation with a soil microbial community

译名：土壤微生物群落降解六溴环十二烷的宏基因组学研究

期刊：Journal of Hazardous Materials

IF：14.224

发表时间：2022.3

通讯作者：施养信，林仲彦

通讯作者单位：台湾大学；中央研究院

DOI号：10.1016/j.jhazmat.2022.128465

实验设计

结果

1 HBCD降解与动力学从台湾台南县取回的Chiang Chun土壤曾被检测过HBCD生物降解潜力。该土壤由45.7%的淤泥、27.0%的粘土和27.3%的沙子组成。采用两阶段的HBCD处理研究Chiang Chun土壤样本中微生物群落对HBCD的持续降解能力。最初，用1 ppm的HBCD对Chiang Chun土壤进行处理(初始阶段)。在HBCD去除率达到约50%后，再添加300 ppb的HBCD(加标处理阶段)。结果表明，在初始处理阶段4天后，50%的HBCD被去除，降解率为0.173/天(图1a)。但HBCD降解动力学降至0.1044/天，需要再过5-6天才能去除剩余的HBCD。考虑到还原脱溴和脱氢溴化是微生物在好氧和厌氧环境中降解HBCD的两个主要代谢途径，本研究还对溴离子浓度进行测定。经测定，Chiang Chun土壤中的初始溴离子浓度为1.6 µM，在HBCD处理四天后上升至4.03 µM(图1a)。理论上，1 ppm HBCD完全脱溴将释放0.76 ppm溴离子。但经过初始处理阶段后，还原脱溴率仅为30%左右。加标处理阶段后的最终脱溴率约为50%，这强烈表明除了脱溴和脱氢溴化外还存在其他生物转化过程。此外，细菌的富集和共代谢以及外加碳源可以增强降解有机污染物的能力，并增加细菌的生物量。因此，我们还测试了不同碳源(包括矿物油、葡萄糖和乙酸钠)下Chiang Chun土壤样品中的HBCD降解率。但在外加碳源后并未观察到HBCD降解率增加(图1b)。在基本培养基(BSM，无额外碳源)中，65%的HBCD在11天后被去除，而在添加矿物油和葡萄糖时，只有40%的HBCD在11天后被去除。当使用乙酸钠作为外加碳源时，只有不到30%的HBCD被降解。外加矿物油、葡萄糖和乙酸钠时，HBCDs的降解速率常数分别为0.073/天、0.097/天和0.054/天。这些结果表明协同生物降解可以在不需要外加碳源的情况下转化HBCD。

图1 Chiang Chun土壤中HBCD的降解。(a)加标处理第4天，Chiang Chun土壤中HBCD的降解。(b)外加碳源对HBCD降解的影响。数据点为三次重复的平均值及标准差。

2 HBCD降解代谢产物根据LC-HRMS提供的精确质谱，提出了四种HBCD生物降解中间体和产物(图2)。此前，通过气相色谱和质谱法鉴定了脱溴和环氧化反应产物，包括五溴环十二烷(PBCDE)、三溴环十二烷(TriBCD)、环十二碳三烯(CDT)和环氧环癸二烯(ECDD)。本研究鉴定了另外四种具有亲水性的HBCD生物转化中间体。在6.42分保留的中间体产生质荷比为532.7732的具有多溴同位素模式的分子离子，符合四溴环十二烷-三醇(TBCD-OH)的分子式(C₈H₁₇Br₄(OH)₃)(图2a)。此外，两个溴和两个羟基的中性损失导致大量质荷比为341.0176的碎片离子(图S1a)，表明TBCD-OH极有可能是在6.42分终时保留的中间体。同样，保留在5.04分的中间体的分子离子(质荷比264.1602，图2c)符合分子式C₁₂H₁₈(OH)₆。结合[M-6OH-6 H]^-(图S1b)片段，该中间体被鉴定为环十二烷己醇(CDT-OH)。此外，环裂解反应也被认为是微生物降解芳香族或脂肪族碳氢化合物的必要步骤。这一点可以从保留在9.30分的六溴十一醇得到证明，其分子离子质荷比为649.6363(图2b)，而C₄H₆的损失(图S1c)可能意味着在裂解过程中发生重排。此外，在保留时间为3 min时，琥珀酸(SA)的存在(质荷比118.029)也可能意味着环裂解。

图2 Chiang Chun土壤中的HBCD生物转化中间体。(a)四溴环十二烷-三醇，(b)六溴十一醇，(c)环十二烷和(d)琥珀酸的光谱。

3 宏基因组测序和系统分类为了进一步研究Chiang Chun土壤的分类多样性及其响应HBCD生物转化的群落动态，使用ONT MinION对Chiang Chun土壤的微生物DNA分两批进行测序。两批合并的原始reads中约90%通过了Guppy的碱基识别和质量过滤，并进一步用于分类学分析。在Metamaps中，尽管由于短读长和低映射率使得许多序列无法分类，但已识别的细菌属数目在所有样本中都达到饱和，并稳定在963个细菌属(图S2)。图3a-b展示了数据集从界到属的分类学图谱。HBCD处理土壤的宏基因组显示，在所有测序样本中，超过96%的reads注释为细菌。真核生物占据约2%的宏基因组，而古细菌和病毒只占不到1%。我们进一步研究了细菌界中属分类水平的组成变化：在最初未经处理的样本中芽孢杆菌(Bacillus spp.)为优势菌群(约37.8%)，其次是Paeniclostridium(约20%)、梭菌(Clostridium)(约16.3%)和Lysinibacillus(约9%)。在初始HBCD处理后，我们观察到芽孢杆菌属的百分比上升至42.8%，且加标处理后仍在稳定增长，表明对芽孢杆菌而言HBCD没有毒性影响，土壤环境良好。HBCD初始处理后，Aneurinibacillus、短波单胞菌(Brevundimonas)和梭菌(Clostridium)的相对丰度也分别激增至2.5%、9%和23.2%。但HBCD处理后，Paeniclostridium、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)、Clostridioides和类芽孢杆菌(Paenibacillus)的组成百分比显著下降了100%。

此外，Shannon多样性指数表明，初始处理一天后收集的样本在所有样本中多样性最高。相反，第5天的样本在加标处理一天后多样性最低(图3c)。此外，所有样本之间的Bray-Curtis相异度如图3d所示。结果表明，微生物群落在HBCD处理后发生了显著的结构变化。在所有数据点中，未经HBCD处理的原始样本相似性最小，而第1天、第4天、第5天和第6天采集的土壤样本聚集更为紧密。这有力地支持了我们的假设，即HBCD等外源性诱导物可以改变微生物群落动态。

图3 HBCD处理对微生物相对组成和多样性的影响。(a-b)HBCD处理后不同时间点的微生物在界水平(a)或属水平(b)的相对组成。(c-d)HBCD处理后微生物相对组成的多样性。使用Shannon指数(c)和Bray-Curtis相异度(d)对α和β多样性进行测定。

4 HBCD对微生物群落组成的影响及系统发育分析为了评估Chiang Chun土壤中受HBCD处理影响的细菌，我们通过共丰度网络分析对初始和加标处理组的细菌群落进行检测。首先，我们将拓扑相关分类群分组到模块中，在初始处理组中创建13个微生物模块，在加标处理组中创建15个微生物模块(图4a-b)。接下来，我们通过模块-性状相关热图(图4c-d)，探索了包含与HBCD处理和降解相关的分类群的微生物模块。初始处理组的黑色模块和加标处理组的蓝绿色模块与HBCD处理和降解高度正相关，被选择用于下游分析。我们进一步分析了这些微生物模块中的分类群，发现大多数分类群在模块成员关系和HBCD降解方面表现出高度相关性(图4e-f)，表明这些分类群在HBCD处理后具有相似的丰度模式，并与土壤中HBCD的减少相关。

为了分析HBCD处理后差异丰度细菌，我们对初始处理组(图S3a-b)和加标处理组(图S3c-d)中秩和相对丰度差异最大的微生物进行检测。我们在比较秩差异和相对丰度差异时发现细菌组成存在广泛的差异。相对丰度较低的细菌如Flavisolibacter、Chelativorans、Brevundimonas和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)通常存在显著差异。

图4 HBCD处理后细菌群落的共表达网络分析。(a-b)分类群树状图。树状图中的每个尖端代表一个微生物，根据聚类结果用模块颜色标注。(c-d)模块-性状关系图。单元格的颜色根据Spearman的ρ值进行指定。(e-f)散点图显示所选模块中分类群与样本性状、HBCD降解或模块特征值的相关性。

5 降解HBCD的细菌类群的特征为了鉴定HBCD降解细菌，我们检测了来自不同分析结果的交叉细菌。结果表明，在初始处理组和加标处理组中，分别通过至少两种分析方法同时鉴定出11种和23种差异丰度细菌(图S4)。大多数交叉细菌通过两种分析方法得到鉴定，初始处理组中的草螺菌(Herbaspirillum)则得到了所有方法的鉴定。完整的交叉细菌信息见附表1。为表征HBCD降解细菌的特征，我们首先研究了它们的系统发育和相对丰度模式。在比较初始处理组时，我们发现除了属于芽单胞菌门(Gemmatimonades)的Gemmatirosa之外，大多数得到鉴定的细菌属于变形菌门(Proteobacteria)(图5a)。相比之下，在比较加标处理组时，虽然大多数细菌也属于变形菌门，但也发现了许多不同的门，如疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和放线菌门(Actinobacteria)(图5b)。我们还检查了相对丰度模式，其中大多数细菌在初始处理组和加标处理组中相对更丰富(图5a)。但并不是所有的细菌的丰度都在两组中增加(图5b)，一些细菌如Coraliomargarita和Leptospirillum只在加标处理组中丰度增加。除了探索HBCD降解菌的系统发育和相对丰度模式外，我们还进一步检测了这些交叉细菌是否能降解HBCD。我们参考微生物代谢途径数据库MACADAM调查了这些细菌的分子途径。我们分析了涉及卤化化合物降解、芳香族化合物降解、水解酶、细胞色素c氧化酶和谷胱甘肽S-转移酶(GST)的途径，以将HBCD降解与特定细菌属a相关联，如玫瑰堆积图和相关网络所示(图6和图S5)。

结果显示，来自两个处理组的六个重合细菌属，包括鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、Azospirillum、短波单胞菌(Brevundimonas)、Caulobacter、Altereythrobacter和Microvirga，参与了所有分析的代谢途径。分析的草螺菌(Herbaspirillum)、Citromicrobium和Croceicoccus的代谢基因和途径仅在处理初始阶段被检测到，特别是包含所有检测基因和途径的。经分析，Croceicoccus含有GSTs和水解酶，而Citromicrobium仅含有GSTs。在加标处理阶段，更多的细菌被检测出有助于HBCD生物转化过程。除了与初始处理组重合的细菌外，还确定了13种在加标处理阶段专门参与HBCD降解过程的细菌：Phenylobacterium、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)、Leptospirillum、Thalassospira、Chelativorans、黄色杆菌(Xanthobacter)、Flavisolibacter、Aneurinibacillus、厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus)、Coralimoargarita、Oblitomonas、Humibacter和Limnobacterium(图6)。

图5 HBCD降解细菌的系统发育热图。通过系统发育树和丰度比例热图(z分数)对初始处理组(a)和加标处理组(b)的比较中的关键交叉细菌属进行分析。

图6 初始处理组(红色)和加标处理组(蓝色)的细菌属差异表达。计算五个途径类别在每个交叉细菌中的比例。色块范围代表每个途径所占比值，颜色代表不同的处理阶段。

讨论

2013年，《斯德哥尔摩公约》将HBCD列为持久性有机污染物。对秀丽隐杆线虫、大肠杆菌和斑马鱼的研究表明HBCD对内分泌系统、早期发育和能量吸收代谢有慢性不良影响。但许多生物制剂被发现具有减弱HBCD毒性或将其从环境中去除的能力。据报道，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Sphingobium chinhatense和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等生物制剂都能将HBCD生物转化为脱溴类似物和其他毒性较小的化合物。一些复合菌群也可以降解HBCD：据报道，来自废水处理厂(WWTP)的厌氧菌群在42天后降解了92.4%的0.5 ppm HBCD，使溴离子浓度增加321 ppb，还检测到脱溴产物二溴环十二烷(DBCD)。在这个菌群中，拟杆菌的数量在HBCD处理12天后增加到47%，而Azospira、Microbacterium和Archromobacter等重要性较低的细菌数量也增加了22倍以上。含有Dehalocococoides菌株195的人工混合培养物在42天后也能去除75%的12 µM的HBCD。这项研究发现，从当地农田收集的土壤无需进一步的细菌增强或同化即可降解HBCD。Chiang Chun土壤在四天内可有效去除约50%的1 ppm HBCD，速率类似于废水处理厂的厌氧菌群(0.13–0.19 /天)和我们之前的有氧研究，但快于Le等人进行的有氧研究(40天后分别减少29%和57–60%)。充足的营养源是微生物在各种环境中茁壮成长的另一个关键因素，特别是在应对不利的外来胁迫，如持久性污染物时。已有许多研究报道额外的碳源或含有多种外源物质的共代谢可加速生物转化和修复过程。共代谢生物修复已被用于包括四氯乙烯、三氯乙烯、三硝基甲苯和二恶烷在内的最难降解的污染物。当与复合碳源代谢时，Citrobacter sp. Y3能有效降解HBCD，降解动力学为0.156–0.290 /天。然而，我们在Chiang Chun土壤中没有发现额外碳源对HBCD生物转化的刺激作用。相反，使用额外碳源处理土壤时观察到HBCD降解动力学和效率的减慢，这表明土壤微生物群落中可能存在共代谢，而额外的养分流入可能破坏了既定的途径，并进一步阻碍HBCD分解效率。识别生物转化代谢物有助于确定参与催化研究较少的持久性有机污染物生物转化的潜在酶。结合宏基因组和代谢组学数据可以缩小环境中生物修复的关键角色的范围。几种HBCD降解或生物转化代谢产物已得到研究和鉴定。绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)HS9中细胞色素P450编码基因cyp168A1参与HBCD分解代谢。异源表达的6×His-CYP168A1通过脱溴和氢化降解HBCD，表明新型CYP是HBCD生物降解的初始脱卤酶。这些发现与我们研究中发现的编码细胞色素P450的基因相匹配，如图6所示。来自Sphingobium indicum B90A的卤代烷脱卤酶LinB通过羟基化脱溴转化了所有三种HBCD立体异构体，还鉴定到五溴环十二烷醇(PBCDOHs)和四溴环十二烷二醇(TBCDDOHs)。AchromobacterHBCD-1能在8天内降解90%的0.5 μg/mL HBCD。更重要的是长链烷烃副产物2-十二烯的发现，使其更容易被微生物降解。Dehalococcoides mccartyi195是一种厌氧脱卤细菌，可以利用卤化有机化合物作为电子受体，代谢HBCD四溴环十二烯(TBCD)和其它还原脱溴代谢物。在Chiang Chun土壤中也观察到由Pseudomonas aeruginosa HS9代谢物催化的1,2-环氧-5,9-环十二碳二烯，这意味着环氧化途径是微生物中比之前研究表明的更常见的HBCD代谢途径。最近，一种新的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GJY被鉴定通过还原脱溴和羟基脱溴代谢转化HBCD，并且仅通过羧化作用进行催化，其中观察到环裂解产物二溴十二烯二酸。本研究发现另一种环裂解代谢物六溴癸醇是土壤微生物群落生物转化HBCD的中间产物。琥珀酸是一种四碳二羧酸，也是三羧酸(TCA)循环和能量代谢的关键中间体。我们也成功地鉴定琥珀酸为HBCD生物转化的代谢物之一。基于这些证据，我们提出了土壤环境中微生物群落对HBCD进行生物转化的途径：首先，卤酸脱卤酶和卤代烷烃脱卤酶进行一系列脱溴反应，与此同时或随后进行羟基化反应。然后，类似于芳烃开环反应的开环反应将产生长链烷烃化合物。其中一种代谢产物琥珀酸随后将进入TCA循环以产生能量，从而导致生物量增长。本研究发现微生物群落及其动态响应与HBCD分解动力学密切相关。初始处理组和加标处理组的微生物组成相似。但两组之间仍然存在一些差异。β多样性(图3d)表明，试验初始处理阶段的细菌群落组成不同于加标处理阶段收集的样本。此外，两组差异丰度细菌间的不同可能表明一些细菌在HBCD降解过程中由于吸收了初始HBCD降解菌分泌的营养物质而数量增加。例如，短波单胞菌(Brevundimonas)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)的丰度在这两组中都有所增加，且在已鉴定的HBCD降解途径中所涉及的基因比例较高。相比之下，Humibacter只出现在加标处理组，且没有在HBCD降解途径中占很大比例的基因，说明Humibacter的生长与HBCD降解没有直接关系。本研究采用三种方法鉴定潜在的HBCD降解细菌，包括检测初始处理组和加标处理组的秩差异、相对丰度差异和细菌群落变化。秩差异表明一些含量较低的细菌可能是降解HBCD的微生物。相比之下，相对丰度差异揭示了一些高度丰富的细菌由于其丰度较高，可能是降解现象的关键。第三种方法是细菌共丰度网络分析，它对整个细菌群落进行分析。网络分析显示了细菌丰度模式的差异，有助于研究人员识别随着HBCD处理而丰度增加的细菌。通过这些方法发现的交叉细菌包含了数据库中与HBCD降解相关的途径(图6)。此外，通过相对丰度差异和细菌共丰度网络分析，确定了初始处理组和加标处理组中存在的大多数交叉细菌，其中包括Brevundimonas、Phenylobacterium、Sphingomonas和Azospirillum等。这一结果表明本研究中降解HBCD的细菌群落是一致的。在这些微生物中，一些论文表明鞘氨醇单胞菌与HBCD的降解有关。Le等人发现，鞘氨醇单胞菌可能有助于HBCD的转化。据报道，Sphingobium indicum B90A可降解HBCD，Sphingomonas paucimobilis UT26可降解分子结构类似于HBCD的六氯环己烷(HCH)。一种转化六氯环己烷的微生物Sphingobium chinhatense IP26，可以在6天内有氧降解约20-41%的HBCD。这些细菌之间可能存在的代谢联系可以在未来进行研究。环境监测对于系统识别污染问题至关重要。宏基因组学、地球化学测量和代谢组学等系统的方法经常被用来研究复杂的微生物群落和污染降解的外源性限制。宏基因组学方法使我们能够获得更全面的多层次生物转化特征。许多研究已经成功地将宏基因组学应用于生物修复研究。采用宏基因组学方法对参与总石油烃(TPH)还原的受污染地下水中的微生物群落进行的研究表明，以短波单胞菌(Brevundimonas)为主的变形菌负责生物修复过程。柴油污染的微生物群落多样性降低，优势菌群由变形菌门转为放线菌门。此外，结构和功能基因类别在应对外部环境压力(如有机污染物)时也发生了显著改变。本研究还观察到HBCD处理后功能途径和关键参与者的波动，表明不利的环境刺激可能触发细菌的替代代谢途径。重金属污染土壤中也有大量Xanthobacter和Sphingomonas的报道。受污染的地下水微生物群落中草螺菌(Herbaspirillum)占很大比例，表明它们在巨大的环境压力下具有恢复力本研究证明了Chiang Chun土壤微生物群落对HBCD的有效生物转化，其降解动力学达到了与废水处理厂中厌氧菌群相似的水平。通过纳米孔测序和生物信息学分析，我们还确定了HBCD处理后微生物组成的变化。首先，基于微生物多样性分析，我们观察到初始处理阶段和加标处理阶段的微生物组成存在差异。之后我们对微生物群落组成进行了分析，并对差异丰度细菌进行鉴定。最后，在鉴定了特定的HBCD降解细菌类群后，我们提出了HBCD降解机制中的途径。结合宏基因组学方法和代谢产物研究，我们成功地填补了在自然土壤环境中HBCD生物转化的知识空白。该模型可进一步用于更好地观察和监测新型微污染物对当地环境微生物的影响。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389422002539

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