【文献解读】田纳西大学Ragauskas教授团队Green Chemistry：利用碱杀菌的方法提高木质素生物转化效率

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背景介绍

木质素作为自然界体量最大的可再生芳香族原料，具备转化成塑料、脂质和精细化学品的巨大潜力，但解聚过程中木质素的异质性通常会导致复杂的芳香族化合物产生，给利用木质素生产精细化学品带来了许多技术挑战。在自然界中，多是真菌主导木质素大分子的解聚过程，木质素解聚衍生的非均质物质更多的是被细菌代谢。而细菌多样化的分解代谢系统及日益完善的遗传操作技术使得生物法定向转化木质素成为可能。

在木质素生物转化过程中，发酵培养基内木质素分布的均匀性对于生物转化效率影响很大。制作木质素培养基时，传统的高温灭菌过程会使木质素发生缩合反应导致木质素颗粒聚集影响培养基分布的均匀性。碱性环境可以提高木质素的分散性且高浓度OH^-也会导致生物大分子变性失活，因此也可以用于灭菌，但其对发酵性能有何仍不确定。

针对这些问题，美国田纳西大学Authur J. Ragauskas教授团队提出了用碱法灭菌代替高温灭菌的策略，并对其发酵效率的综合影响进行了评价。结果表明，碱法灭菌不仅可以达到完全无菌的效果，而且能有效改善木质素在培养基中分布的均匀性使其更容易被微生物利用从而显著提高木质素的生物转化性能。

02

图文解读

Fig. 1 Flowchart of different sterilization treatments of lignin-containing medium. ASL: Alkaline sterilized lignin, ATSL: alkaline and thermally sterilized lignin, NSL: non-sterilized lignin, TSL: thermally sterilized lignin.

本研究以纯化过的针叶材硫酸盐木质素为碳源，对比四组经过碱处理24小时/30分钟（目的为提高木质素分散度）后高温灭菌/未灭菌的培养基，将其分别命名为ASL（24小时，未灭菌）、ATSL（24小时，灭菌）、NSL（30分钟，未灭菌）及TSL（30分钟，灭菌）。对比30分钟的培养基发现碱处理24小时后的培养基虽然没有经过高温灭菌的过程仍能达到无菌的效果。由于在木质素生物加工中，通常会加入氢氧化钠促进木质素的溶解，以提高其分布均匀性因此碱法灭菌过程不会对培养基产生额外的化学物质污染。

Fig. 2 pH changes during mixing lignin-containing medium at initial pH12.7 and the subsequent neutralizing process by adding HCl. The data represent the average of two replicates. Error bars represent standard deviations.

由于溶液pH值对木质素分散体的形成起着重要作用。为了促进木素在发酵培养基中的增溶，在制备木质素培养基时通常将pH调至12.0以上然后中和至7.0-7.5以促进微生物生长。这一过程多存在碱性环境中酸性基团电离反应。带负电荷的木质素分子结构增强了木质素的静电斥力从而有助于减轻胶态木质素粒子的聚集。如图2所示，在24 h的混合过程中溶液的pH值不断下降，表明酸性基团仍在电离（–COOH和Ar–OH），酸性基团的电离更充分，从而有效地提高了胶态木质素结构的稳定性。

Table 1 Precipitates weight percentage in lignin medium after different sterilization treatment

Fig. 3 Comparison of colloidal lignin hydrodynamic size distributions in different media before and after fermentation.

表1中的沉淀重量百分比表明在ATSL和TSL介质中，高温灭菌后形成了木质素沉淀。特别是TSL，沉淀质量占全部木质素底物的20.5%。为了进一步表征木质素的分散性，作者通过检测动态光散射（DLS）来评估胶态木质素颗粒的尺寸分布，图3结果显示，发酵前的ASL和TSL培养基分布相对较窄，粒径相对均匀。其中TSL发酵前水动力半径是ASL的3倍也表明高温灭菌会使木质素颗粒聚集，胶粒增大甚至导致沉淀。而对于ATSL，长时间的碱处理使木质素胶体更加稳定，高温处理破坏胶体颗粒的程度相对较小，水动力半径结果呈多峰分布。

而对于发酵后的木质素颗粒，相比原始峰值ASL介质的主峰值左移，表明大部分木质素颗粒被微生物代谢破坏导致颗粒变小。对于ATSL培养基，由于发酵前胶态木质素粒径分布较广而小颗粒更容易被微生物利用，导致发酵后分布的宽度变窄，而TSL培养基中木质素颗粒体积大导致其本身微生物活性较弱，所以发酵前后木质素粒径分布变化较小。

Fig. 4 Comparison of weight-average molecular weight (M w ) and molar-mass dispersity (Đ M ) of lignin from different sterilization treatments. RKL: Raw Kraft lignin, ASL: alkaline sterilized lignin, ATSL: alkaline and thermally sterilized lignin, NSL: non-sterilized lignin, TSL: thermally sterilized lignin. TSL-S and TSL-P represent lignin from supernatant and precipitates of TSL medium, respectively. The data represent the average of two replicates. Error bars represent standard deviations.

图4结果显示，重均分子量（Mw）和摩尔质量分散度（ĐM）的大小依次为RKL（原木质素）>NSL>ASL，说明碱处理降低了木质素的分子量的同时改善了其均匀性。木质素的分子量随着溶液中–COOH和Ar–OH的电离程度的升高而降低，这与前文的描述一致。对于低分子量木质素（ASL），热灭菌引起的Mw略有增加，而对于高分子量木质素（NSL）Mw从1432 g•mol⁻¹降至1207 g·mol⁻¹说明在高温灭菌过程中可能同时发生解聚和再聚合反应。进一步比较上清液（TSL-s）和沉淀物（TSL-p）中木质素的分子量更加证实了高温灭菌会使木质素的分子结构发生明显变化。

Fig. 5 NMR characterization of lignin with different sterilization treatments. (a) Aliphatic region of HSQC NMR spectra. (b) Main substructures identified: (A) β-O-4-aryl ether, (A-G) β-O-4-guaiacyl unit, (B) β-5-phenylcoumaran, (C) β–β-resinol linkages. (c) Relative abundance of lignin interunit linkages. (d) Quantification of different hydroxyl group contents determined by ³¹ P NMR spectra.

图5a中HSQC NMR结果显示，TSL中β-O-4连接键的相对含量相比NSL降低了4.05%，而ATSL中β-O-4连接键的相对含量比ASL高3.55%（图5c）。这与高温灭菌后木质素分子量的变化趋势相似，而图5d中³¹P NMR数据显示，ASL和ATSL的–COOH含量达到0.60 mmol·g^-1木质素，高于NSL和TSL。这些结果与pH变化趋势及胶态木质素粒径分布结果一致。如公式，在碱法灭菌过程中更多的–COOH与OH^-反应导致pH降低，产生更多负电荷的木质素胶体结构。这些结果也阻碍了木质素颗粒的聚集，导致粒径变小。结合图4图5，ASL的木质素Mw最低且在所有培养基中木质素分布最均匀最利于微生物的利用。

Fig. 6 Comparison of microbial growth curves of R. opacus PD630 (a),lipids production, and lignin degradation (b) during fermentation on different media. The data represent the average of two replicates. Error bars represent standard deviations. Bars followed by different letters show significant difference (P < 0.05) according to the Duncan’s multiple range test.

为了研究不同灭菌方法对R. opacus PD630菌株发酵性能的影响，作者又比较了三种灭菌培养基对PD630细胞生长、脂质产量和木质素降解的影响。图6a中可以看到虽然微生物在发酵前期（1-3天）普遍生长缓慢但在ASL培养基中这一阶段的细胞数量最高，这可能是由于ASL颗粒更小，木质素分子量更低，因此易于被微生物细胞获取。在七天的发酵过程中，ASL（4.1倍）和ATSL（3.3倍）培养基中的细胞数量始终高于TSL培养基。木质素降解和脂质产量的增加顺序为TSL<ATSL <ASL，这与微生物细胞生长趋势相似（图6b）。

Fig. 7 Lignin molecular weight (a), molar-mass dispersity (b), and significant aromatic monomer metabolites contents (c and d) variations during fermentation in different media. The data represent the average of two replicates. Error bars represent standard deviations.

在观察发酵过程中木质素颗粒大小及木质素分子结构和初级代谢物含量的变化发现，发酵第一天木质素的Mw均快速增加，而ĐM快速下降。这是由于较低分子量的木质素优先被微生物利用，高分子量在这一阶段则留在培养基中。而后续的发酵过程中木质素的Mw开始下降，ĐM增加，表明高分子量木质素通过微生物代谢产生碎片。观察芳香产物香草醛（vanillin）和罗布麻宁（apocynin）的相对含量变化发现，香草醛的含量变化同PD360的生长曲线密切相关，说明其为发酵过程中的关键代谢产物。

Fig. 8 Proposed model for elucidating the mechanisms of enhanced lignin bioconversion by alkali sterilization. Sample information was presented in Fig. 1.

结合前文结果，作者提出了碱法杀菌可以有效稳定木质素的机理。不同于高温灭菌，碱法灭菌没有引起木质素沉淀反而改善了木质素在培养基中的分布，为微生物细胞提供更均匀的可获得的底物。而不经高温灭菌的ASL中具有更均匀且分子量小的木质素颗粒，更易被降解并转化成活性芳香烃从而更容易被微生物利用。此外，碱法灭菌策略将增溶和灭菌作为一个单元操作，省去了高温灭菌步骤并简化了操作。节省蒸汽的同时发酵罐不再需要承受高温和压力。

03

结论

本研究提出了一种新的碱法灭菌的策略，用以取代传统的高温灭菌达到促进木质素分散并显著提高发酵性能的目的。碱处理增强了木质素胶体中酸性基团的电离，相比常规高温杀菌可使木质素胶体颗粒体积减少96.3%，而木质素的分子量和摩尔质量分散度分别降低了23.0%和23.8%。通过提供更均匀和易于降解的木质素底物这一方法显著促进了PD630的生长以及脂质的高效生产。本项工作提出的这种简单有效的灭菌策略，克服了水发酵介质中木质素分布不均的问题，显示了其作为平台技术促进生物定向转化木质素的巨大潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1039/D1GC00911G

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