关于CAR-NK细胞疗法，从六个维度分析

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自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞 )，是一类先天淋巴细胞，具有识别和消除病毒感染细胞及肿瘤细胞的能力。随着CAR-T细胞疗法取得了颠覆性成功，大家对NK细胞在抗肿瘤免疫疗法中的潜力也兴趣倍增。

自从CAR-T疗法上市后，CAR-NK细胞疗法如雨后春笋般迎来投资狂热，各大细胞企业或相关企业纷纷布局。然而，临床推进似乎并不像CAR-T细胞疗法一样顺利。CAR-T细胞疗法的经验依然值得CAR-NK细胞疗法借鉴，但是机制带来的差异也需要解决。

关于CAR-NK细胞疗法，笔者有六点要谈：

-01-

病毒载体与转导选择

目前，获批用于商业用途的八款CAR-T产品，都是使用慢病毒或逆转录病毒载体转导生产的，由于GVHD的风险，仅用于自体使用。其中，水疱性口炎病毒G蛋白（VSV-G）慢病毒是生产CAR-T细胞最常用的伪分型受体。

与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转导更安全，因为具有较低的遗传毒性和插入诱变。通常，原代NK细胞中慢病毒转导的效率较低，通常需要多轮转导。

同时，CAR-NK细胞疗法的GVHD风险很小。但是，其低密度脂蛋白受体的表达水平也很低，而这是VSV-G的主要转导受体。因此，需要选择NK细胞转导特异性的载体。

目前认为，狒狒包膜伪型慢病毒载体（BaEV-LV）可显著提高NK细胞的转导效率。此外，通过类病毒颗粒运送CRISPR基因组编辑成分，也逐渐成为热门的方法。转导CAR和基因敲除可以共同进行。

Mol Ther Methods Clin Dev.

电穿孔和脂质转染等转染方法，也被用于将外源基因递送到NK细胞中。目前，著名的转座子系统包括PiggyBac和睡美人等。与病毒转导相比，NK细胞的转染与转基因的表达更快，细胞凋亡水平更低，个体间变异性更小，基因转移效率更高有关。

不过，转座子系统在转导原代NK细胞中的适用性，仍需要进一步修改，以克服转导效率低和质粒DNA电穿孔对NK细胞的细胞病变效应等问题。

-02-

CAR-NK细胞的持久性

CAR-NK细胞持久性不如CAR-T细胞，这是NK细胞疗法临床疗效有限的原因之一。目前认为，短期接触IL-12、IL-15和IL-18可产生持续时间更长的记忆样NK细胞。

临床前预处理，也是CAR-NK细胞临床应用持久性的影响因素之一。通常，在接受CAR-NK细胞治疗之前使用氟达拉滨/环磷酰胺的组合，以减少宿主对NK细胞的排斥反应，重新编程免疫抑制的肿瘤微环境，并降低肿瘤负担。

细胞剂量上，在过继转移未经修饰的NK细胞疗法之前，高剂量方案能够更好地使体内NK细胞的扩张和持久性满足需求，而低剂量方案不能。

不过，持久性要到什么程度才合适？

是越长越好吗？

也不尽然。

目前认为，仅需要在特定的肿瘤中强调增强NK细胞的持久性。CAR-T细胞疗法的经验表明，在比如淋巴瘤等类型中，患者可以在不延长CAR-T持续时间的情况下产生持久的反应。这或许是CAR-NK细胞可以借鉴的。

到目前为止，优化NK细胞CAR结构的目标大多集中在提高细胞毒性上，而非持久性。CAR-NK的低免疫原性，还使其能够通过多次给药来弥补持久性问题。

-03-

CAR-NK细胞的迁移能力

CAR-T细胞改善其迁移能力（Trafficking）的途径包括：通过CAR设计表达趋化因子受体、联合给药、改变给药途径等。这三种策略对CAR-NK细胞都有用。

NK细胞本身在正常免疫中就使用趋化因子信号，经修饰表达CXCR2、CXCR4、CCR5或CCR7的NK细胞，均被证明能增强小鼠的迁移功能，同时增强其抗肿瘤能力。但是并不影响其产生细胞毒性细胞因子的程度和NK细胞的直接肿瘤杀伤活性。

Sig Transduct Target Ther.

-04-

CAR-NK细胞的营养代谢

营养代谢主要是针对实体瘤的适应症。在肿瘤微环境中，相当多的营养代谢屏障阻碍了免疫细胞发挥功能，包括：缺氧、缺乏营养、低pH值和各种代谢产物水平升高。

具有优化代谢功能的CAR-T细胞产品，如有更高的氧化磷酸化，已被证明在临床上更有效。例如在CLL患者中，CD8+T细胞在刺激后表现出受损的激活和葡萄糖摄取减少，长期暴露影响代谢稳态，导致刺激时代谢重编程异常。CLL衍生的CD8+T细胞在受到刺激时显示出线粒体生物发生受损。

Blood

改善代谢的策略包括：

• 通过在体外扩增过程中直接操纵细胞代谢；
• 基因工程改造T细胞。NK细胞也适用。

例如，采用mIL-21在体外扩增NK细胞和CAR-NK细胞的研究显示：扩增所得的与富集代谢途径相关的NK细胞分化程度较低，未耗尽表型、记忆样表型的比例提高，并能抑制CAR-NK细胞的“自相残杀”。

Mol Ther Methods Clin Dev.

NK细胞比T/B细胞更容易受到肿瘤微环境中过氧化氢的影响。有研究通过基因改造NK细胞使其过表达过氧化物还原蛋白-1（PRDX1），该细胞在氧化应激下对乳腺癌细胞显示出有效的抗肿瘤活性。

Cancer Immunol Res.

-05-

肿瘤抗原丢失的影响

CAR-T细胞目前的探索包括：

• 设计双靶点CAR-T细胞；
• 不同CAR的CAR-T细胞顺序给药；
• 联合溶瘤病毒给药。

不同于CAR-T细胞，NK细胞能够通过先天受体（NCR、CD16、DNAM-1或NKG2D/DAP10等），在CAR抗原丢失或者下调的肿瘤逃逸环境中保留非CAR依赖性杀伤能力。

此外，双靶点CAR-NK细胞目前也有临床前开发，例如包含具有NKG19D跨膜和2B2/CD4ζ信号结构域的CD3靶向CAR表达。

Blood

-06-

胞啃作用的影响

胞啃作用（Trogocytosis）：信号传导影响、抗原丢失、自相残杀。

Frontiers in Immunology

▉ 胞啃作用的积极影响：

通过胞啃作用，NK细胞可以获得趋化因子受体（如CCR5、CXCR4、CCR7或TYRO3等）。CCR7的获得，增强了NK细胞归巢到淋巴结的能力，而TYRO3则提高了效应器的功能和增殖水平。

▉ 胞啃作用的抑制影响：

通过胞啃作用，CAR-NK细胞可获得免疫抑制蛋白来抑制其细胞毒作用。例如：在白血病环境中，NK细胞能从白血病细胞上获得PD-1；在卵巢癌中，NK细胞从卵巢癌细胞上获得CD9，抑制细胞毒作用。克服胞啃作用介导的信号传递是使用针对目标抗原的封闭抗体。例如在卵巢癌中，有研究通过在CD9的情况下，使用CD9阻断抗体在体外恢复NK细胞的细胞毒性。

Cell Rep.

▉  胞啃作用与靶细胞抗原丢失

胞啃作用的另一个后果是靶细胞抗原丢失。虽然这已经在CAR-NK细胞中显示出来，但它在CAR-T细胞中得到了更多的研究。由于抗原密度影响CAR的功能，靶抗原的下调或内化可导致肿瘤逃逸。因此，克服胞啃引起的抗原丢失可以提高肿瘤的清除率。

第一种方法是通过调整CAR与靶抗原的亲和力。低亲和力结构被认为能在保持疗效的同时减少了胞啃作用。在CAR-T细胞疗法中已有临床前研究证明，低亲和力的CD19 CAR-T细胞能够显着限制胞啃作用，同时保持抗肿瘤活性和临床疗效。

 Leukemia

另一种方法是调整CAR的信号域。因为胞啃作用已被证明在不同程度上影响具有CD28或4-1BB信号域的CARs。不过这种机制的影响效果差异很大，主要取决于抗原密度。

胞啃作用使抗原转移到NK细胞的最终结果是，介导了NK细胞对其他NK细胞的杀伤。在内源性T细胞或NK细胞的抗原（如CD7或CD38）的背景下，敲除效应细胞中的靶抗原可以克服同胞杀伤，但这种方法不适用于通过胞啃转移到效应细胞的抗原。

-07-

小结和未来展望

说不热门吧，CAR-NK在血液瘤和实体瘤中均有不少企业布局。2023年5月6日，国家药品审评中心（CDE）受理了启函生物的同种异体CD19 CAR-NK的IND申请；

说热门吧，不少备受关注的CAR-NK细胞产品则临床迟迟没能推进。行业先锋的Fate还在2023年1月5日宣布与强生的合作终止，同时选择聚焦开发第二代CD19 CAR-NK疗法，终止开发FT596项目。

这正是表明，CAR-NK细胞结构和设计上的迭代需求和技术，都已经赶上了实际临床试验的推进进度。这也给后来的企业更多的机会，通过技术弯道超车，未尝不可实现。

参考资料：

[1]Kilgour Marisa K., Bastin Donald J.,et al.Advancements in CAR-NK therapy: lessons to be learned from CAR-T therapy. Frontiers in Immunology 14 2023. 

[2]Jo DH, Kaczmarek S,et al.Simultaneous engineering of natural killer cells for CAR transgenesis and CRISPR-Cas9 knockout using retroviral particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023 Mar 15;29:173-184. 

[3]Xie G, Dong H,et al.CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 2020 Sep;59:102975.

[4]Jaco A.C.van Bruggen, Anne W. J. Martens,et al.Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy. Blood 2019; 134 (1): 44–58. 

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[6]Ruyan Rahnama, Challice L. Bonifant; Engineering builds multipotency for iPSC-NKs. Blood 2022; 140 (23): 2414–2416.

[7]Hamieh, M., Dobrin, A., Cabriolu, A. et al. CAR T cell trogocytosis and cooperative killing regulate tumour antigen escape.Nature 568, 112–116 (2019).

[8]Li, Y., Basar, R., Wang, G. et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med 28, 2133–2144 (2022). 

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来源：闲谈 Immunology

审校：南风 

声明：本文仅作为科普，拒不接受商业用途的转载申请，亦不构成任何建议。

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