深度学习助力首颗透明大脑问世，2D技术骤变3D
“结构决定功能”是自然世界中的一条金科玉律。从微观的蛋白质构象到宏观的左右半球的连接，我们对大脑的认识有赖于对其结构的理解。在各国脑计划的蓝图中，也有相当一部分研究旨在绘制人和其它动物大脑结构和功能的图谱。
人类目前掌握的技术中，磁共振成像技术实现了对大脑非侵入地实时成像，但即便处于最高分辨率，一个体素中仍包含十多万个神经元，这离看清单个细胞还差的很远；组织染色虽能将细胞结构呈现得一清二楚，但局限于薄至全脑体积千万分之一的大脑切片。要想看清楚每一片组织，需要巨量的劳力和经费支持，还要设法通过算法将2D图像重建为3D大脑，以调整机械切割造成的形变。如若能增加观察样本的体积，上述过程将大大简化。光学组织清除技术（Optical Tissue Clearing Method）应运而生，它或许能让厚达数厘米的组织块染色成为现实。
作为一种新兴生物化学技术，光学组织清除旨在使大块组织变得透明且易于染色。结合深层组织标记与激光片层显微成像系统，它目前已经可以将啮齿动物整体透明化后成像。但由于脂褐素等色素、不溶性胶原和各种脂质的阻碍，同样的方法难以照搬到人脑中。如若通过现行方法光学清除8毫米厚的人脑组织，所需时间要10个月，标记深度也小于1毫米。
为了解决这一难题，来自德国慕尼黑大学和组织工程与再生医学研究所（Insititute for Tissue Engineering and Regenerative Medicine）的团队在一篇发表于《细胞》的论文中，提出了一种名为SHANEL（Small-Micelle-Mediated Human Organ Efficient Clearing and Labeling），由小胶束介导的人体器官高效清除与标记）的方法，可使组织清除和标记试剂渗入完整的哺乳动物器官中实现成像，并提出了与之配套的深度学习方法分析影像数据。
论文题目：
Cellular and Molecular Probing of Intact Human Organs
DOI：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.01.030
01
将大脑变得透明
该研究认为传统方法的标记效果之所以不理想，是因为常用清除剂十二烷基硫酸钠和Triton X-100会在溶液中形成大体积胶束，因此难以深入到组织内部。在此基础上，该论文的研究团队发现了一种新的两性分子CHAPS（3-[3-9(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐）。其特殊的“表面两亲性”使得其形成的胶束体积较小，能够迅速渗透到器官之中，不与蛋白质发生作用，并能在完成任务后被完全洗脱。
为了验证CHAPS的穿透效果，研究首先在猪脑上开展了实验。实验人员将一颗12.0×7.3×5.0cm大小的成年猪脑用CHAPS透化、N-甲基二乙醇胺（NMDEA）脱色、乙醇脱水、二氯甲烷脱脂、苯甲醇与苯甲酸苄酯匹配折射率后，在一个半月的时间里就让富含髓鞘的白质、丘脑和脑干变得透明。
透明的人脑
接下来，研究团队将目光转向了人脑。他们以人脑中的四根动脉为管道搭建起了一套压力泵循环系统，在清理血液残留并固定后，采用上述SHANEL方法透化。4个月后，经过短波红外成像、高强度白光透射和磁共振成像三重验证，该研究首次得到了一颗透明且完整的成人大脑。
02
观察透明大脑
由于活体基因标记和荧光染色无法用于人体，为了看清大脑结构，研究人员只能诉诸抗体与化学染料。然而使用已有方法，抗体分子量大，穿透力差，标记深度仅能达到1mm，而且还存在荧光分子随时间积累造成的强背景干扰等诸多问题。为了解决这些难题，研究在经过SHANEL透明化处理的脑组织中进一步尝试了抗体标记。
实验团队以一位92岁女性捐献者的大脑为样本，首先使用CHAPS和NMDEA对大脑进行透化和脱色处理，待其软化后切割成12片1.5厘米厚的冠状切片，随后用二氯甲烷和甲醇脱脂，并用醋酸和盐酸胍放松细胞外基质。经过这些前处理后再使用常规方法染色，结果表明化学染料Methoxy-X04和TO-PRO-3可穿透1.5厘米的脑组织使Aβ淀粉样斑块和细胞核分别着色，抗离子钙接头蛋白分子（Ionized Calcium Binding Adaptor Molecule 1，Iba1）和抗酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）抗体同样也能标记组织内部的小胶质细胞和神经元，且染色结果能稳定保留数月，标记深度较同类研究提升了1~2个数量级。
用SHANEL透明化处理人体器官
© HELMHOLTZ ZENTRUM MÜNCHEN / ERTÜRK LAB
在片层扫描显微镜的帮助下，研究者可以将标记好的大脑扫描成数字信号储存到硬盘中。但随之而来的TB级数据分析又是一个棘手的问题。得益于近年来迅速发展的计算机视觉技术，该研究采用卷积神经网络（Convolutional Neural Networks，CNN）与成分分析技术，开发出了可用于人脑组织图像检测、分割与细胞计数的模型。在60~145mm³的四个脑样本中，该模型能在数小时内检测、分割并匹配1~2.2千万个细胞。与目前最先进的软件相比，其能在同等准确率下较Imaris Surface Detection Tool快出10倍，在表现优于Fiji 3D Object Counter的前提下快出20倍，相关代码已于Google Colab开源。
03
SHANEL的意义与转化前景
本研究以具有特殊“表面两亲性”的分子CHAPS为基础，开发出了一套可使完整动物器官透明化，将其标记成像并通过深度学习分析数据的完整方法，将生物医学研究中传统的“切片-染色”的2D研究范式骤然推向了3D整体成像。
对致力于绘制人和其它动物大脑结构与功能图谱的研究而言，这种方法的进步或许能让原本需要逐一研究的千万片大脑切片缩减成数十个组织块，极大地减少了研究成本与时间。对其它生物医药研究来说，器官整体染色不仅能提供更加完整的结构信息，还能避免机械切割造成的组织形变与损伤，让我们对自己的身体有更加完整、准确的认识。
根据中国人体器官捐献与移植委员会的统计，目前我国年均新增器官衰竭患者数量约为30万，其中仅有不到2万人能顺利移植，按照45万元/次的移植手术均价计算，市场空间约为1300亿元。为了解决器官移植供体短缺问题，科学家一直在尝试利用3D生物打印技术人工制造器官，但受限于我们对肾脏等器官整体结构的认识，难以取得突破性进展。SHANEL技术的出现则刚好弥补了这一短板，迫切的临床需求与巨大的市场空间也将给类似SHANEL的技术带来诱人的转化前景。
参考文献
Zhao, Shan, et al. "Cellular and molecular probing of intact human organs." Cell 180.4 (2020): 796-812.
作者：郑宸
编辑：光影 | 排版：光影