Cell | 高效解密人类鳞状细胞癌图谱，空间转录组这样用！

斯坦福大学Paul A Khavari教授团队整合空间转录组等高维多组学方法来描述人皮肤鳞状细胞癌（Squamous Cell Carcinoma ，cSCC）的特征，确定了肿瘤特异性角化细胞群体以及肿瘤前沿的免疫浸润和异质性。研究成果于2020年在线发表在Cell 期刊。

文章题目：Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma

发表时间：2020-07-23

发表期刊 ：Cell   

主要研究团队：斯坦福大学Paul A Khavari教授团队等   

影响因子：38.634  

DOI：10.1016/j.cell.2020.05.039

研究背景

在人体的恶性肿瘤中，约90%是上皮细胞性肿瘤。人皮肤鳞状细胞癌作为其中的一种，是美国第二大常见的癌症类型，比乳腺癌、肺癌和前列腺癌更常见，每年发病人数超百万。尽管可以通过切除治疗，但仍有高达4%的cSCC会发生淋巴结转移，并且1.5%的患者最终会不幸死亡。Cemiplimab（PD1抑制剂）的上市为晚期和转移癌患者带来了希望，但是肿瘤标志物预测响应的不足，迫切需要更好的方法对肿瘤微环境（TME）进行特征描述。本研究通过单细胞测序、空间转录组等技术，揭示cSCC的肿瘤异质性和免疫机制，为肿瘤和免疫动力学研究提供支持。

研究方法

实验材料

人组织：10名cSCC患者正常皮肤和癌组织 (63-98岁)

人细胞系：SCC-13、A431和CAL27

鼠：Crl: SHO-Prkdc^scidHr^hr、NOD.Cg-Prkdc^scid II2rg^tm1Wjl/SzJ，雌性（8-9周）

实验技术

单细胞RNA-seq、空间转录组测序、CRISPR筛选等

实验流程

研究结果

cSCC的多模式分析

研究对10例患者手术切除的肿瘤和原位正常皮肤进行scRNA-seq（图1A），共获得48164个单细胞数据。通过无监督聚类分析确定了肿瘤、正常上皮细胞以及基质细胞亚型(图1B)，并且对骨髓细胞亚群和NK&T细胞亚群进行了细分(图1C&D)。研究为cSCC提供了代表性的细胞图谱。

图1 正常皮肤和cSCC的单细胞转录图谱

TSK细胞亚群

重新聚类正常上皮细胞后，在正常皮肤中观察到3个主要的角质细胞（KC）亚群（基底、循环、分化细胞）。相关分析表明肿瘤KCs广泛重现了正常（基底、循环、分化细胞）亚群，在正常皮肤和cSCC中存在几个共享的标记基因（图2A-D）。有趣的是，在肿瘤细胞聚类中出现了与正常皮肤无明显关联的第四个KC亚群，即TSK亚群(图2B-D)。TSK标记基因与细胞运动和细胞外基质分解有关，暗示了它的侵入性（图2E）。TSKs表达经典的上皮-间质转化(EMT)标志物，如VIM和ITGA5(图2F)；但是EMT类似的TSK细胞缺乏经典表达EMT转录因子(图2H)。因此，通过单细胞调控网络进行推理和聚类，提示AP1和ETS家族成员为潜在控制TSKs的TFs(图2I)。TSK细胞也表现出较大的EMT评分范围，提示细胞状态具备高可塑性(图2G)，与EMT连续模型一致。基底细胞（Basal）在肿瘤中的发生率约是正常循环细胞的4倍(图2K)。总的来说，cSCC表现出分化失常，基底细胞迅速增殖，并出现表达EMT连锁基因的TSK亚群。

图2 肿瘤角质细胞的异常分化层次

空间转录组确定了TSK的组织前沿异质性

使用scRNA-seq中TSK标记基因对每个空间转录组斑点评分，显著突出了一个TSK-high簇，包括TSK标记物MMP10（图3B&C）。在具有清晰前沿的肿瘤中，TSK邻近间质富集了癌症相关成纤维细胞 (CAF)和内皮细胞转录本，表明TSK细胞主要位于纤维血管微环境中(图3D)。结果确定了TSK、Basal细胞以及TSK近端纤维血管生态位造成的cSCC肿瘤前沿的异质性。

图3 空间转录组反映了前沿异质性

cSCC的免疫图谱

为了探究何种细胞类型影响了cSCC的免疫活动，研究调查了熟知的免疫抑制基因(图4A)，CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)等基因在ST中表现出空间簇特异性模式，与特定细胞类型的共定位一致，骨髓特异性因子在炎症前沿占据优势地位(图4B&C)。衰竭的CD4和CD8 T细胞亚群除表达细胞毒性基因外，还表达抑制性受体和衰竭标志物(图4D)。在空间位置上，T细胞转录本出现在炎症前沿和免疫相关细胞簇中(图4E)。并且发现scRNA-seq中几种趋化因子受体在T细胞亚群中高表达。Tregs特异性表达CCR8，这可能是一个潜在药物靶点(图4F)。综上所述，这些结果强调了参与免疫抑制机制的多种细胞类型，包括诱导DC和衰竭T细胞共抑制信号，以及招募Tregs。

图4 CSCC的免疫图谱

映射前沿生态位的细胞串扰

进一步，研究整合scRNA-seq和ST数据来描述前沿邻近肿瘤和TME细胞之间的信号通路(图5A)。基于配体-受体对数据库，TSKs广泛参与了自分泌和旁分泌相互作用(主要与CAFs、内皮细胞、巨噬细胞和MDSCs)(图5B&C)。

图5 与前沿生态位相关联的细胞串扰情景

异种移植再现自发性人cSCC的细胞亚群

使用典型的小鼠模型进行肿瘤亚群功能评估，单细胞测序结果发现异种移植SCC细胞的特征与患者样本基本一致（图6A-C）。来自患者和异种移植数据类似TME细胞类型的比较也显示，人和小鼠之间共享标记物高度重叠，只有异种移植的少量脊髓细胞存在微妙差异(图6D&E)。使用患者肿瘤亚群标志物对体外培养的SCC细胞系进行分析，发现体外细胞在基底、循环和TSK评分方面表现出较小的异质性，这也反映了TME是一个肿瘤细胞群出现的条件(图6F)。综上，异种移植模型概括了cSCC ITH的关键特征。

图6 肿瘤角化细胞缺陷的体内CRISPR分析

体内肿瘤KC亚群基因的CRISPR筛选

接下来，使用CRISPR/Cas9技术对3个鳞状细胞癌移植瘤株进行筛选（4个亚群，334个富集基因），评估肿瘤KC亚群的功能作用(图6A)。通过STARS算法，获得38个命中点，其中18个至少被两种细胞系共享(图6F)。对肿瘤生长重要的基因偏向于在TSK、基底和循环细胞中表达。肿瘤循环KCs特有的参与细胞循环的基因形成了以PCNA和GINS2为中心的最大网络。最大的TSK特异性网络包括ITGB1、FERMT1、CD151、ARPC2、HSP90B1。ITGB1、CD151和 FERMT1的蛋白产物在细胞表面相互作用，介导整合素信号。通过体外实验验证ITGB1、FERMT1和CD151对肿瘤生长的重要性低于体内，证实了如果整合素信号介导与TME的通讯，相关基因在体内肿瘤发生应该比在体外有更大的依赖性的推断。综上，体内异种移植筛查结合TCGA分析突出了可能控制亚群特异性致瘤功能的关键基因。

总结

本文整合单细胞RNA测序、空间转录组和多路离子束成像绘制了人类鳞状细胞癌组成和空间结构的多模式图谱，发现了一个定位于肿瘤前沿的肿瘤特异性角化细胞（TSKs）。TSK在肿瘤微环境的机制探索，体内CRISPR筛选确定的肿瘤亚群致瘤基因网络，为肿瘤和免疫动力学研究提供了极大支持。

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