Nature | 共生菌“指导”肝脏免疫细胞定位，优化机体免疫
美国国立卫生研究院Ronald N. Germain、Anita Gola等研究人员早前在Nature上发表的文章表明，微生物可促进免疫细胞的肝脏分区，优化宿主防御能力。
文章题目：Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence
发表时间：2020-11-25
发表期刊 ：Nature
主要研究团队：美国国立卫生研究院Ronald N. Germain、Anita Gola等
影响因子：49.962
DOI：doi.org/10.1038/s41586-020-2977-2
研究背景
肝脏的基本单位是肝小叶，组织学上用E-钙粘着蛋白划定其区域。肠道的血液通过门静脉进入肝脏，由于单向血流，肝脏中存在氧气、营养素和激素的梯度。已有研究表明肝小叶存在代谢分区，而一些关键酶（如谷氨酰胺合成酶）的区带化也提高了代谢效率。那么肝脏的免疫细胞是否也存在这种分区现象呢？其和代谢分区现象有什么联系？如果存在免疫分区现象，其机制是什么？将对机体免疫系统产生怎样的影响？
研究策略
研究人员应用多参数共聚焦成像技术、小鼠模型、遗传扰动、转录组学、体外实验和数学建模等方法，来评估免疫细胞在肝脏中的定位及其与宿主免疫之间的关系，揭示了肝脏免疫细胞的区带分布现象。这种空间模式的形成，需要肝窦内皮细胞对共生菌群信号感知，从而保护宿主抵抗血液中的病原体扩散。
研究结果
1. 肝小叶中的髓系细胞（如肝巨噬细胞）和淋巴细胞（如NKT细胞）富集于门脉周区域，形成免疫区带现象
研究人员在组织细胞计量的基础上，使用了多参数共聚焦成像技术，证实Kupffer细胞在门静脉周围区域富集，并开发了详细描述这种图像的定量方法；然后用静态和活体双光子显微镜检查了自然杀伤T(NKT)细胞，发现这些细胞也集中在门静脉周围区域；之后使用了透明增强的三维(3D)成像进一步分析，再次看到Kupffer细胞和NKT细胞在门静脉周围区域富集（图1）。总之，这些数据表明，肝小叶中具有免疫分区现象。
图1 Kupffer细胞和NKT细胞在门静脉周围区域富集
2. 肝小叶免疫分区现象由肠道菌群诱导
研究人员试图研究这种免疫分区的机制。Wnt-β-catenin在肝脏代谢中起着重要作用，为了检验这一途径是否也控制免疫细胞，研究人员阻断了小鼠肝细胞中Wnt-β-catenin信号的传递。正如预期，后代在中央静脉周围缺乏谷氨酰胺合成酶，但Kupffer细胞在肝小叶内的位置没有改变。此结果表明，控制代谢分区和免疫分区的因素存在明显的区别。
由于摄入固体食物会导致肠道微生物发生变化，并伴随着免疫学变化，因此研究人员推测共生细菌可能影响肝脏的免疫分区。他们比较了无特定病原体(SPF)和无菌(GF)小鼠中Kupffer细胞的定位。尽管GF小鼠的肝小叶表现出正常的代谢分区，并且具有与SPF对照组相似的Kupffer细胞数量，但GF小鼠缺乏成年SPF小鼠中观察到的Kupffer细胞的门静脉周富集现象（图2）。因此得出结论，这种免疫区带化现象依赖于肠道微生物。
图2 GF小鼠无Kupffer细胞的门静脉周富集现象
3. 肝窦内皮细胞通过Myd88感知菌群信号（如LPS），进而调节参与趋化因子（如CXCL9）梯度形成的细胞周基质组成，从而建立免疫区带化
由于对微生物信号的感知通常由模式识别受体介导，研究人员进一步评估了Kupffer细胞在缺乏关键模式识别受体或下游接头蛋白的小鼠中的定位。免疫区带在Myd88−/−小鼠中丢失，为了确定微生物刺激哪种肝细胞，于是消除了Myd88在特定细胞类型中的表达，结果表明免疫分区不需要肝细胞或Kupffer细胞中的Myd88信号。然而，肝窦内皮细胞（LSECs）中Myd88的丢失扰乱了Kupffer细胞和NKT细胞的门静脉周极化(图3)。这些结果表明，LSECs能够感知微生物信号，并随后介导肝小叶的免疫分区。
为了探讨LSECs调节免疫细胞定位的机制，研究人员使用RNA测序方法检测了小鼠肝脏中Kupffer细胞和LSECs的转录状态。根据CD117(也称为KIT)的表达对LSEC进行排序，以推断它们在小叶内的位置，结果发现许多趋化因子在小叶轴上显示出梯度表达。CXCL9在门脉周围区域的mRNA富集最强，同源受体CXCR3由Kupffer细胞和NKT细胞表达。然后评估了CXCL9-CXCR3在肝脏免疫细胞定位中的作用，配体和受体敲除都显示Kupffer细胞和NKT细胞门脉周围富集减少。这些数据表明，CXCL9对肝脏中免疫细胞的定位有一定作用。
图3 Myd88的丢失扰乱了Kupffer细胞和NKT细胞的门静脉周极化
4. 肝小叶内的免疫区带化使得门静脉周围优先发生局部促炎反应，抵抗血液中的病原体扩散及其引发的肝组织损伤
Kupffer细胞在门静脉周围富集的改变可能导致细菌到达中央静脉，然后进入大循环。研究以单核细胞增多性李斯特菌为模型病原体，比较了Myd88缺陷型（iCdh5-Myd88fl/fl）与iCdh5-Myd88wt/wt小鼠捕获李斯特菌的能力。与野生型对照相比，iCdh5-Myd88fl/fl小鼠到达中央静脉区域的细菌频率增加(图4A)。此外，iCdh5-Myd88fl/fl、CxCR3−/−或Cxcl9−/−小鼠表现出肝脏对病原菌的捕获量减少，同时脾和外周血液病原菌负荷增加(图4A)。这些数据表明，Kupffer细胞在门静脉周围的聚集，在保护宿主免受细菌传播方面起着至关重要的作用。
由于没有既定的方法来改变Kupffer细胞的定位，同时又不会潜在地影响它们的生物学，研究人员设计了一个数学模型，能够定量研究Kupffer细胞的空间定位对它们捕获病原体能力的影响。该模型模拟了Kupffer细胞在毛细血管网络(λ)中的不同密度分布和细菌轨迹，同时保持每个Kupffer细胞的细菌结合概率恒定。当Kupffer细胞的门静脉周围密度较高(λ=25μm)时，病原菌的捕获发生在肝小叶门静脉周围区域，而且捕获能力较高，阻止病原菌到达中心静脉(图4B)。这些数据与在体内的观察结果一致，再加上体外实验，证明了Kupffer细胞的区带化分布是防止肝小叶明显组织损伤的关键因素。
图4A 小鼠捕获李斯特菌的能力差异
图4B Kupffer细胞的空间定位对其捕获病原体能力存在影响
总结
研究人员通过定量多重成像技术，观察到肝脏中的髓样细胞和淋巴样细胞向肝小叶门脉周聚集，并证明这种免疫区带现象的形成需要肝窦内皮细胞持续产生Myd88信号，其通过感知菌群信号（如LPS），进而调节参与趋化因子（如CXCL9）梯度形成的细胞周基质组成，从而建立免疫区带化。在功能上，肝小叶内的免疫分区导致门脉周围区域优先出现局部的促炎反应，以优化宿主防御。
总之，这些发现揭示了微生物群是如何在肝脏中建立免疫分区的，在保护器官功能的同时，形成了一种空间上有效的保护屏障，以抵御来自血液中病原体的传播。
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