JCI Insight| 空间转录组联合单细胞测序揭示小鼠AKI模型中上皮细胞和免疫细胞互作模式

美国印地安那大学医学院的Ricardo Melo Ferreira团队通过单细胞测序和空间转录组测序，揭示了小鼠急性肾损伤模型中上皮细胞和免疫细胞串扰的潜在基因表达模式。该文于2021年06月发表于JCI Insight，以下是详细解读。

文章题目：Integration of spatial and single-cell transcriptomics localizes epithelial cell–immune cross-talk in kidney injury

发表时间：2021-06-22

发表期刊：JCI Insight

主要研究团队：美国印第安纳大学医学院医学系、医学与分子遗传学学系等

影响因子：8.315

DOI：10.1172/jci.insight.147703

研究背景

急性肾损伤(AKI)是一种高发病率和死亡率的严重疾病。研究AKI的治疗靶点需要更好地了解其发病分子机制。尽管对这种疾病的了解取得了重要进展，但由于其具有复杂的肾脏微环境，在细胞和分子水平上对AKI的发病机制仍不完全清楚。

研究策略

研究者利用单细胞和单核RNA测序数据集，将聚类得到的细胞类型映射回人类和小鼠肾脏的空间转录组spots位置上。检测了AKI小鼠缺血/再灌注损伤模型(IRI)和盲肠结扎穿刺模型(CLP)中的差异表达基因(DEGs)和相关信号通路情况。再使用空间转录组测序平台得到的空间转录组信号，将免疫细胞与上皮细胞共定位，确定了这些模型中免疫细胞转录表达的分布情况，发现在这些损伤模型中，上皮细胞中表达的关键趋化因子能促进免疫细胞的浸润和上皮-免疫细胞相互作用。不同免疫细胞类型的分布最后通过空间分辨多重免疫荧光CO-Detection by indEXing (CODEX)来进行了验证。

研究成果

1. 人肾脏空间转录组图谱的无监督mapping和细胞类型鉴定

人肾切除术组织切片取自一位59岁的女性患者中，先经过OCT包埋、H&E染色和显微镜检观察，然后进行透化、RNA分离和空间定位条形码测序，以直接在组织学图像上映射对应的转录组特征(图1A和1B)。根据已知的肾脏区域和细胞类型，使用差异表达的标记基因和潜在的组织学特征来确定和命名这些簇，共生成了9个无监督簇(图1B)，组织学上，收集管(CDs)具有立方体细胞和嗜酸性细胞减少的特征性细胞核。这些小管被高表达水通道蛋白2 (AQP2)的点所覆盖(图1I)。如上所述，根据已知的肾细胞类型的基因表达标记将spots分类成簇(图1J)。

图1 人类肾切除术样本的空间转录组学特征

2. 小鼠肾脏空间转录组细胞类型的定位

AKI并不会对肾脏的所有区域造成统一的影响。损伤的病因可能不同程度地影响基因表达的空间分布，特别是在疾病的早期过程中。因此，我们将空间转录组学应用于2种常见的AKI模型中(IRI和CLP)。sham、IRI和CLP模型的无监督空间转录组聚类映射图。6小时时间点的3种模型样本用H&E染色的组织病理学损伤情况如图2A。图2B用从Space Ranger获得的簇覆盖了每个部分。有两个簇只存在于IRI模型中:间质和尿路上皮簇，后者可能与切片中棘突的大小有关。例如，远端肾元的DCT、CNT和CD都聚集在了一起。同样，PT S3片段簇定位于外条纹，还包含了来自邻近TAL的基因表达特征。用于识别这些clusters的标记基因子集如图2D所示。

 图2 小鼠肾损伤模型的空间转录组学特征

3. 损伤模型中的区域表达差异和通路富集

在两种模型的皮层中，研究人员通过测量所有基因的总reads数，观察到每个spots的总表达水平存在区域差异(图3A)。研究人员选择了IRI和CLP模型的边界区域，与sham相比，尽管组织病理学证据表明损伤很小，但这些区域的总表达量有所减少。将这些IRI和CLP中“低”表达的区域与大小匹配、表达相对“保守”的区域进行比较，低表达区域也与sham中相同大小的区域进行了比较。

在不考虑聚类名称的情况下，研究人员鉴定出了在IRI低表达区和对应的sham表达区上所有spots的DEGs (图3B)，几种富集信号通路已被确认与氨基酸和脂肪酸的代谢有关，可能与缺氧相关的代谢转移有关。其他途径与明显的损伤反应机制相关，如凋亡、氧化应激和p38 MAPK级联反应。

研究人员推测，IRI区域细胞核的相对丢失是由于间质水肿造成的，因为在IRI后6小时内不会出现广泛的细胞凋亡。IRI模型中分配到间质簇的spots数量比sham区域增加，sham区域没有分配到间质簇的spots。受损组织的上皮细胞数量减少可能是这种分布转移的原因。

对CLP模型进行了同样的分析。CLP低区和sham区之间的DEGs和富集通路与CLP模型中已知的变化一致，包括p53信号、细胞周期阻滞、凋亡、TNF信号和巨噬细胞分化(图3E和3F)。

图3 小鼠肾损伤模型中的区域基因表达情况

4. 免疫细胞和上皮细胞转录组标记在IRI和LPS模型spots中的共定位

（图4A和4B）分别显示了sham模型和IRI模型上的免疫细胞和成纤维细胞簇的空间分布。中性粒细胞scRNA-Seq簇在IRI模型中特异性映射到髓质外条纹的空间转录组spots上(图4D)。研究人员分别分析了PT(S3-OS)相关spots中中性粒细胞共定位和其他免疫细胞类型共定位的DEGs情况(图4E)。发现Atf3(激活转录因子3),一种中性粒细胞迁移的调节因子，其特异性表达定位于髓质外条纹(图4F)。Atf3蛋白也类似的表达于外条带(图4G)。与未共定位的PT(S3-OS)相比，与中性粒细胞共定位的PT(S3-OS)中Atf3的表达更高;在PT(S3-OS)中，Atf3的表达也高于其他所有上皮细胞类型(图4H)。

图4 缺血/再灌注损伤模型（ISI）中免疫clusters的共定位

研究人员随后研究了CLP切片上scRNA-Seq免疫细胞簇的转移情况(图5A)。在CLP模型中，研究人员分析了与浸润性巨噬细胞簇共定位的PT spots和与其他任何免疫细胞/成纤维细胞共定位的PT spots之间的DEGs情况(图5D)。与巨噬细胞共定位相关的最高DEGs是Midkine(Mdk)，一个编码与巨噬细胞募集相关的生长因子的基因，该基因在CLP切片的外皮层高表达(图5E)。与未与巨噬细胞共定位的皮质PT spots或所有其他上皮细胞类型相比，Mdk在与浸润巨噬细胞共定位的皮质PT spots中表达更高(图5F)。与Atf3相比，Mdk在scRNA-Seq数据集中的表达(图5G)并未明确出表达Mdk的PT细胞亚群。除了巨噬细胞标记与PT标记共定位外，在CLP模型中，也观察到了NK细胞标记和近端小管标记之间的共定位。

图5 盲肠结扎穿刺模型（LPS）中免疫clusters的共定位

总结

本研究展示了AKI小鼠模型中的空间转录组特征，但这项工作是描述性的。需要进一步的研究来了解肾脏中这些免疫细胞信号的因果关系。在未来，这项技术可以帮助肾脏病理学家解释肾脏活检标本，将特定损伤基因的上调与特定肾结构联系起来的能力是至关重要的，这可能会改变科研人员对AKI疾病的分类及疾病的诊疗。

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