华大DNBelab C4平台应用专题：绘制食蟹猴全细胞“地图”，揭秘再生医学新突破 | 时空简讯21期
时空简讯第21期。
单细胞测序技术的发展日新月异，相关研究已进入超高通量、超大数据研究阶段。华大自主研发的单细胞建库测序平台——DNBelab C4，具有高通量（单次试验可有效捕获1,000~12,000个细胞）、样本兼容性强（细胞悬液、血液、新鲜组织、珍稀冻存组织样本均可实现细胞研究）、成本低（DNBelab C4系统单细胞捕获，搭载国产化DNBSEQ-T7测序平台）等优势，可实现千万级单细胞转录组文库测序和数据分析挖掘，已被广泛地应用于组织再生研究、脑科学研究、哺乳动物图谱绘制、肿瘤发生机制研究等。目前，华大DNBelab C4平台已取得多项重磅科研成果，发表文章20余篇，平均影响因子（IF）高达17+。本期简讯特就华大DNBelab C4平台在生命发育、结构及机理领域发表的代表性8篇文章进行简述，以供参考。后续也将推出DNBelab C4平台相关优质文章的简讯，敬请关注。
干细胞
Stem Cells
体细胞诱导培养出达到八细胞胚胎样阶段的人类多能干细胞
Nature [IF: 49.962]
① 开发了一种非转基因、快速且可控的细胞重编程方法，从体细胞诱导培养出了类似受精卵发育3天状态的人类全能性的8细胞期胚胎样细胞（eight-cell-like cells，8CLC），并基于华大自主研发的DNBelab C4平台，对8CLC诱导过程的细胞样本进行了scRNA-seq和scATAC-seq，全面分析了8CLC群体的特征，在多个诱导时间点描绘了8CLC诱导过程中转录组和染色质开放性的动态变化（https://db.cngb.org/search/project/CNP0001454/）。
② 将得到的全能干细胞注射到小鼠体内进行进一步发育，然后用单细胞基因组分析法进行分析，得到8CLC转化过程的分子路线图，进而确定DPPA3和TPRX1是诱导8CLC的核心因子，其中DPPA3诱导整个8CLC转化过程中的DNA去甲基化，而TPRX1属于一种同源盒转录因子，主要在8CLC中发挥作用。
③ 8CLC可以在体外和体内产生胚胎和胚胎外谱系：体外实验产生滋养层干细胞和类囊胚，生物活体实验生成畸胎瘤，这使其成为研究早期人类胚胎发生的宝贵资源。（杨博林）
从人类多能干细胞生成8细胞阶段全能性胚胎样细胞的示意图
Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage.
2022.03.22，DOI：10.1038/s41586-022-04625-0
研究文章；生命机理；人，胚胎，多能干细胞，胎盘细胞，全能性，scRNA/scATAC-seq，DNBelab C4平台；Md. Abdul Mazid, Carl Ward，Longqi Liu, Wenjuan Li, Miguel A. Esteban；中国科学院，中国科学院大学，深圳华大生命科学研究院；中国
脑科学
Brain Science
snATAC-seq解析成年大鼠皮层分区调节的差异和多样性
Frontiers in Molecular Neuroscience[IF: 5.639]
① 基于DNBelab C4平台进行snATAC-seq，全面分析大鼠听觉皮层（auditory cortex，AC）、初级视觉皮层（primary visual cortex，V1）、躯体感觉皮层（somatosensory cortex，SC）和运动皮层（motor cortex ，MC）共11份脑皮层样本的染色质可及性状态，共得到总共59,023个细胞，鉴定了16种细胞类型，包含了9类神经元细胞和7类非神经元细胞，建立了大鼠皮层单核染色质图谱，为神经系统疾病的研究提供了数据资源。
② 比较细胞构成和计算每个聚类中皮层区域基因活性得分，发现不同的皮层区域在细胞构成和基因调控区域上都表现出多样性。
③ 使用ArchR通过无偏基序鉴定来识别与细胞类型特异性开放染色质区域高度相关的转录因子（TF），确定了一组（PU.1、KLF4、KLF6、Neurod2）已被证明与神经系统疾病（阿尔茨海默病、星形胶质细胞胶质瘤、自闭症谱系障碍和智力残疾）发病机制和治疗密切相关的TF。（张书琪）
实验设计和数据分析示意图
Single-nucleus chromatin accessibility landscape reveals diversity in regulatory regions across distinct adult rat cortex.
2021.05.17, DOI: 10.33892/fnmol.2021.651355
研究文章；脑及神经科学，生命结构；大鼠，大脑皮层，染色质可及性，调节元件，转录因子，DNBelab C4平台，snATAC-seq；Yeya Yu, Xiaoyu Wei, Qiuting Deng, Yong Hou, Longqi Liu;深圳华大生命科学研究院，中国科学院大学；中国
哺乳动物图谱绘制
Mammal Atlas
食蟹猴的细胞转录组图谱
Nature [IF: 49.962]
① 利用华大自主的单细胞分离建库技术DNBelab C4和DNBSEQ测序技术，对8只（5雄3雌）6岁成年食蟹猴的45个器官，约114万个细胞进行了scRNA-seq、scATAC-seq测序及整合分析，分成了113种主要的细胞类型和463种细胞亚类，绘制了食蟹猴全身器官细胞图谱。
② 利用该图谱，既可以找到组织特异型基因表达特征，也可以找到不同组织共有细胞类型（骨骼肌细胞、内皮细胞、基质细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞）的基因表达特征异质性。
③ 基于该图谱，重建了驱动Wnt信号通路的全身受配体互作网络，发现食蟹猴远端曲部肾小管LGR5+细胞富集程度高于人和小鼠，LGR5在食蟹猴少突胶质祖细胞和人类少突胶质细胞高表达。
④ 病毒受体与共受体表达分析，构建了126种病毒易感细胞类型的病毒数据库，可查询病毒的易感细胞类型以及该细胞类型可能分布的器官，以COVID-19为例，新冠病毒受体TMPRSS2存在全身广泛性表达，而ACE2仅在肺泡、胰腺、肾脏、胆囊、视网膜和睾丸等特定细胞类型中表达。
⑤ 该数据集与人类遗传病同源基因比对，确定了潜在的细胞与疾病的临床相关性，以阿尔茨海默病为例，其临床特征富集于免疫细胞。
⑥ 搭建了非人灵长类动物百万单细胞交互式网站NHPCA（https://db.cngb.org/nhpca/），为类人物种的系统发生提供了海量注释资源，用户可用此数据库或上传自有数据获取不同组织中的细胞聚类信息、基因表达/共表达情况、跨物种比较信息和细胞间配体受体相互作用。（舟江海）
成年食蟹猴45个组织的细胞图谱
Cell transcriptomic atlas of the adult non-human primate Macaca fascicularis.
2022.04.13, DOI: 10.1038/s41586-022-04587-3
研究文章；生命结构；食蟹猴，全身组织，生物信息学，DNBelab C4平台，scRNA-seq，scATAC-seq；Lei Han, Xiaoyu Wei, Chuanyu Liu, Giacomo Volpe, Zhenkun Zhuang, Xuanxuan Zou, Zhifeng Wang, Yong Hou, Xun Xu, Miguel A. Esteban, Longqi Liu；深圳华大生命科学研究院，深圳湾实验室，中国科学院大学生命科学学院，华南理工大学，吉林大学，中国科学院广州生物医药与健康研究院；中国
孕妇外周血单核细胞的单细胞图谱
Clinical and Translational Medicine [IF: 11.492]
① 基于华大自主研发的DNelab C4平台，对来自131名孕妇（妊娠6~40周）及作为对照的5名健康未孕女性的198,356个外周血单核细胞进行scRNA-seq，发现孕妇和未孕女性具有共同免疫特征：两组样本间免疫细胞类型相同，包含单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等，而两组之间的差异性在于孕妇体内的单核细胞、增殖T细胞和浆细胞的相对丰度在妊娠周期中发生了显著性变化。
② 对不同妊娠期和非妊娠状态下差异表达基因的分析，发现妊娠晚期STAT1和IRF9基因表达上调，可能参与激活NK细胞对干扰素的免疫应答反应和病毒反应；
③ T细胞中TCR信号通路信号在整个妊娠期间表达下降，一些调节T细胞发育和激活的重要TCR信号因子的减少，如CD3D、CD45、LCK等。此外，一些参与选择性mRNA剪接通路激活的基因上调，如HNRNPL因子等，可能导致T细胞活性的降低。
④利用scRNA-seq数据建立了转录组时钟（transcriptomic clock），应用LASSO算法与随机森林模型开发了一个根据特异性的细胞类型预测正常妊娠中胎儿胎龄的工具。（Max）
研究设计及主要发现
Single-cell atlas of peripheral blood mononuclear cells from pregnant women.
2022.05.11, DOI: 10.1002/ctm2.821
研究文章；生命机理；人，孕妇，外周血，单核细胞，DNelab C4平台，scRNA-seq；Dongsheng Chen，Jianmin Niu；深圳华大生命科学研究院，中国科学院大学，中山大学附属第八医院，华中科技大学同济医学院；中国
snRNA-seq构建小鼠出生后肝脏发育的单核细胞转录组图谱
Frontiers in Cell and Developmental Biology [IF: 6.684]
① 基于华大自主的单细胞DNBelab C4平台，对出生后小鼠肝脏发育的4个关键时间点（P0、P3、P7、P14）的82,967个细胞核进行snRNA-seq，整合分析鉴定出28种肝细胞类型，并分析了这一过程中细胞组成和功能的动态变化，以及肝细胞分化轨迹，为进一步了解出生后肝脏发育的基本生物学事件，如肝细胞分化过程、血管生成和出生后代谢功能的获得等，提供了有价值的数据资源。
② 深入表征肝细胞的不同亚型和功能，鉴定出3种未成熟的肝细胞亚型（高表达Afp、H19和Ahsg9）和胆管细胞（高表达Spp1和Onecut2），发现Dlk1、Nope、Cd24a、Prom1和Epcam等成肝细胞经典标记基因表达缺失，提出小鼠出生后肝脏中只有未成熟的肝细胞且具有很强的细胞可塑性。
③ 发现一种特异表达原钙粘蛋白家族基因（Pcdhg3和Pcdhg11）的新HSC亚型（Stellate 2），进一步注释获得两个分别表达LEC和Kupffer标志物的细胞亚型（Stellate 2/Kupffer和Stellate 2/LEC），通过Cellchat分析表征两个异质亚群的多种细胞通讯功能，包括VEGF、AGT和CDH信号通路等。
④ 解析在肝细胞分化过程中酵解/糖异生、氧化磷酸化、HIF-1信号通路、胆汁分泌、JAK-STAT、WNT等多种信号通路的改变，并确定不同细胞类型特异转录因子活性，包括激活肝脏特异基因Alb和Ttr的FOXA2、HNF4A等肝细胞分化因子，以及胆管分化因子SOX9等肝脏发育必要调控因子。（徐晓静）
小鼠出生后肝脏snRNA-seq实验设计与生信分析流程图
Transcriptomic profile of the mouse postnatal liver development by single-nucleus RNA sequencing.
2022.04.06, DOI: 10.3389/fcell.2022.833392
研究文章；生命发育；小鼠，肝脏，肝细胞分化，DNBelab C4平台，snRNA-seq；Jiangshan Xu, Shijie Hao, Chuanyu Liu, Longqi Liu；中国科学院大学，深圳华大生命科学研究院；中国
整合scRNA-Seq和ATAC-Seq分析人胎盘的间充质干细胞/间质细胞
Frontiers in Cell and Developmental Biology [IF: 6.081]
① 采用流式细胞术、scRNA-seq和scATAC-seq技术，分析扩增培养的人足月胎盘的间充质干细胞/基质细胞（mesenchymal stem/stromal cells derived from placenta，PMSC），首次为PMSCs的转录组和表观基因组特征提供了一个全面和整合的观点，揭示了单细胞多组学水平上的PMSCs的细胞异质性。
② scRNA-seq分析共得到31,219个细胞，富集确定了5个不同的PMSC簇，鉴定到2个与免疫调节相关的PMSCs亚组：簇3和簇0，分别被命名为免疫调节1和免疫调节2。其中免疫调节2高表达FOS、IGFBP3和MEG3，免疫调节1高表达CLEC11A、TAGLN、CUL4B、IGFBP6和COX7A1高表达，提示免疫调节1可能与免疫调节能力细胞状态有关，该状态与免疫调节2具有多种共同特性，但活性更强，且免疫调节2可处于成熟的免疫调节能力细胞状态，具有更强的分化能力。
③ 基于DNBelab C4平台，采用scATAC-seq分析共获得17,410个单细胞，识别出C1（仅54个细胞，无独特的分子特征模式）、C2、C3、C4共4个细胞簇，将scATAC-seq数据与scRNA-seq数据进一步整合分析，发现在PMSCs中，免疫调节相关基因的染色质可及性特征较转录水平更为清晰，而细胞周期基因相关的异质性在转录水平上较在染色质可及性水平上更易区分。
④ 推断出一种新的转录因子PRDM1，它可能通过激活PRDM1-调控环（PRDM1-Regulon Loop），在维持PMSCs的免疫调节潜能细胞状态中发挥关键作用。（Lina）
研究设计流程图
Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta.
2022.04.05, DOI: 10.3389/fcell.2022.836887
研究文章；生命结构，细胞机理；人，细胞异质性，间充质干细胞，免疫调节潜能，DNBelab C4平台，scRNA-seq，scATAC-seq；Jinlu Li, Quanlei Wang, Zhouchun Shang; 中国科学院大学，深圳华大生命科学研究院，暨南大学；中国
家猪单细胞转录组图谱及肺单细胞转录组在线平台ScdbLung
Journal of Genetics and Genomics [IF: 4.275]
① 利用华大自主研发的DNBelab C4平台对3个月龄的家猪肺进行scRNA-seq，共获得13,580个细胞，鉴别到16个主要的细胞类型，首次绘制了家猪肺的单细胞转录组图谱。
② 基于家猪肺的单细胞转录组图谱，系统表征和比较了对家猪和人肺部各个细胞类型中的细胞间通讯和呼吸道病毒受体表达特征，并对猪-人异种器官移植中的免疫障碍和凝血功能失调相关的10个基因表达特征进行分析。
③ 分析保守转录组因子及其潜在调控基因，针对人和猪共有的主要细胞系，构建了5个特异性转录因子调控网络。
④ 构建了一个肺单细胞转录组在线数据库平台ScdbLung（http://120.79.46.200:81/Lung/index.php），目前已提供了人、小鼠、猪、大鼠4个物种肺部单细胞数据资源。（trans F）
基于DNBelab C4平台绘制猪肺单细胞图谱的设计流程图
A high-resolution cell atlas of the domestic pig lung and an online platform for exploring lung single-cell data.
2021.04.30, DOI：10.1016/j.jgg.2021.03.012
研究文章；生命结构；猪，肺，转录因子调控，信号通路，跨物种比较，DNBelab C4平台，Lijing Zhang, Jiacheng Zhu, Haoyu Wang, Dongsheng Chen, Xingliang Zhang；中国科学院大，华大生命科学研究院，深圳市儿童医院，广东医科大学附属医院；中国
功能细胞筛选
Screening of Functional Cells
DNBelab C4平台实现单细胞水平的抗原特异性T细胞高通量功能筛选
Analytical Chemistry [IF: 6.986]
① 基于华大自主的单细胞DNBelab C4技术平台，结合液滴微流控、荧光细胞报告系统，实现单细胞水平的高通量筛选肿瘤抗原特异性TCR-T （T cell receptor-gene engineered T cells），达到更高通量筛选（每小时数百万液滴筛选）、更快分类速度（数秒内完成对目标TCR-T细胞分类）和更高准确率的水平，为推动T细胞抗肿瘤治疗开发和免疫治疗筛选提供精确高效的TCR筛选和功能验证工具。
② 建立一套有效的基于荧光的液滴筛选平台，通过设计两种微流控芯片（chip1和chip2）完成液滴的生成和分选，评估生成液滴生成的均匀性、变异系数以及细胞浓度对液滴包封的影响，并利用流式细胞术验证了分选结果的准确性。
③ 将TCR文库和TCR信号下游的报告基因共转导构建报告细胞，经液滴包裹完成单个TCR-T细胞和靶细胞共孵育，利用荧光蛋白的表达识别单细胞水平的TCR-T和功能表征，克服TCR-T细胞间潜在互相作用的非特异性表达，并为后续建立检测多种TCR-T和多种抗原间互作的方法提供技术支持。
④ 对分选的肿瘤抗原特异性TCR-T细胞进行scRNA-seq，获得11,860个TCR-T单细胞转录组，并从基因表达、差异基因功能和细胞发育轨迹等角度证明了TCR与抗原肽-MHC分子复合物（peptide-MHC，pMHC）相互作用的分子机制，有助于后续基于液滴微流控检测TCR-T细胞和肿瘤细胞互作的科学探索和应用研究。（徐晓静）
肿瘤抗原特异性TCR筛选平台流程图
High-throughput functional screening of antigen-specific T cells based on droplet microfluidics at a single-cell level.
2021.12.01, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c03678
研究文章；时空技术；人，肿瘤抗原特异性，T细胞，DNBelab C4平台，TCR-T，scRNA-seq，液滴微流控平台；Shiyu Wang, Yang Liu, Zida Li, Longqi Liu,Ya Liu；深圳华大生命科学研究院，深圳大学；中国
系列导读
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