Cell Reports | 空间转录组解析哺乳动物精子发生

精子发生是精子产生的生物学过程，在控制雄性生育能力中起着至关重要的作用。来自美国Broad研究所的陈飞团队利用空间转录组技术（Slide-seq），通过精确定位小鼠睾丸细胞类型和重建组织结构，再现了精子发生，并揭示了睾丸微环境的空间组织及其在糖尿病条件下的变化。该文章于2021年11月发表在Cell Reports，以下是详细解读。

文章题目：Dissecting Mammalian Spermatogenesis Using Spatial Transcriptomics

发表时间：2021-11-02

发表期刊：Cell Reports

主要研究团队：美国Broad研究所

影响因子：9.423

DOI：10.1016/j.celrep.2021.109915

研究背景

精子生成于睾丸的曲细精管（又称生精小管），不同的精原干细胞在曲细精管中按照特殊的细胞联系排列，形成所谓的精子发生过程。scRNA-seq可以捕获生殖细胞在每个发育阶段的基因表达谱的异质性，但会丢失细胞所处的空间环境，不能在曲细精管的自然环境中描述其动态。因此，需要一种能够高分辨率的无偏、高通量分子谱方法来捕获睾丸细胞的空间背景，以真正再现体内精子的发生。

研究策略

研究人员使用空间转录组学技术Slide-seq生成了睾丸的空间细胞图谱，以接近单细胞分辨率捕捉小鼠和人类睾丸中的空间基因表达模式。利用Slide-seq数据，研究人员设计了一个计算框架，可以精确定位单个曲细精管中的睾丸细胞类型，无偏分析系统地识别了空间模式的基因和基因过程。结合Slide-seq和靶向原位RNA测序，证明了小鼠和人类睾丸精原细胞微环境的细胞组成存在显著差异。最后，对野生型和糖尿病小鼠睾丸生成的空间图谱进行比较，发现曲细精管的空间细胞组织发生了破坏，这是糖尿病导致男性不育的潜在机制。

研究成果

1. 构建小鼠精子发生的空间转录组图谱

Slide-seq阵列直径（3 mm）允许完全覆盖成年小鼠睾丸横截面。平均每个珠子784±25（n=3）个转录本，平均每个阵列的珠子总数为29,333±1514（n=3）。使用基于NMFreg的统计方法和scRNA-seq参考将睾丸细胞类型映射到Slide-seq珠上，得到了反映曲细精管结构（图1C）和睾丸细胞类型已知位置（图1D）的细胞类型分配。通过在相应的细胞类型簇中富集细胞类型标记基因，进一步证实了细胞类型分配的准确性。

在细胞类型分配之后，研究人员试图将曲细精管的信息和曲细精管上皮周期的阶段分配给每个珠。首先进行伪时间分析，沿着转录轨迹对每个珠子进行排序。该分析总结了已知的生殖细胞发育轨迹，该轨迹起源于基膜，并向曲细精管的管腔迁移（图1E）。然后，研究人员开发了一个计算管道，根据重建的伪时间图像保留了曲细精管横截面的形态细节的观察结果，自动对属于同一曲细精管的玻片序列珠进行分组（图1F）。最后，一个生精周期可分为几个亚阶段，每个阶段包含不同的生殖细胞亚型关联。通过将具有已知阶段依赖性表达模式的基因的表达谱投射到分段曲细精管的UMAP上（图1G），将每个小管分配给4个主要阶段簇（阶段I~III、IV~VI、VII~VIII和IX~XII）中的一个（图1H）。

综上，通过将每个Slide-seq珠分配给相应的细胞类型、曲细精管和阶段，生成了小鼠精子发生的空间细胞图谱。

图1 构建小鼠睾丸空间转录组图谱

2. 曲细精管SP基因的系统鉴定

睾丸细胞类型在曲细精管水平存在空间隔离。因此，具有空间非随机分布的基因可能在不同的细胞类型或亚细胞类型中发挥作用。为此，研究人员使用空间转录组图谱在单个曲细精管水平上识别具有空间非随机分布的基因（SP基因）。通过应用基于广义线性空间模型的统计方法，从3个正常小鼠样本中收集103个曲细精管，系统地鉴定了阶段I~III、IV~VI、VII~VIII和IX~XII小管的277、702、298和665个SP基因，其中许多基因的空间表达模式以前未被描述过（图2A）。在所有SP基因中，57.9%（589）是先前确定的细胞类型富集基因。研究人员通过smFISH确认了SP基因识别的准确性。此外，一些SP基因的空间表达模式仅限于4个阶段簇中的一个。

研究人员进一步对已识别的SP基因进行GO富集分析。尽管精子细胞发育和分化等信号通路在所有阶段都是共享的，但研究人员发现某些信号通路具有阶段富集性（图2D）。与细胞分裂相关的过程，包括Sycp家族等基因，在第9至第12阶段富集（图2E），这与观察到的减数分裂主要发生在第9至第12阶段小管一致。此外，GO富集分析发现，一组SP基因在与染色质重塑相关的信号通路中富集。在精子发生（精子发生的最后阶段）期间，减数分裂后的精子细胞经历了一个显著的染色质重塑过程，其中单倍体精子细胞中的大多数组蛋白被鱼精蛋白取代。为此，研究人员重点研究了在DNA构象变化、DNA包装和细胞核组织的信号通路中富集的SP基因。这些基因包括体细胞组蛋白成分H3f3b，睾丸特异性组蛋白变体Hils1、H2bl1和H1fnt，转换蛋白基因Tnp1和Tnp2，以及鱼精蛋白基因Prm1和Prm2。通过从图谱中提取被指定为精子细胞的Slide-seq珠，并根据它们所属的阶段对它们进行排序，观察了它们在精子发生过程中的基因表达谱（图2E）。

综上，研究人员成功地利用空间转录组数据重现了精子发生过程中组蛋白到鱼精蛋白转变的时间动力学。

图2 曲细精管中SP基因的系统鉴定

3. Habp4与精子细胞染色质重塑有关

SP基因Tssk6和Habp4也在与染色质重塑相关的信号通路中富集。TSSK6是一种睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸激酶，已被证明是精子发生过程中组蛋白向鱼精蛋白转化所必需的。相比之下，Habp4在睾丸中的功能作用尚不清楚。为了揭示Habp4的生物学功能，研究人员使用空间图谱和smFISH分析了其在所有阶段集群中的空间表达模式，发现在精子细胞群中，Habp4在小管腔附近高度表达，但主要在I~III期和IX~XII期小管中表达（图2F）。

接下来，研究人员假设如图2E所示的Tssk6和Habp4相似的时间表达模式也可能表明功能相似。生化研究表明，组蛋白乙酰化，尤其是组蛋白H4乙酰化，促进了组蛋白的置换。免疫荧光分析显示，乙酰化H4和HABP4蛋白在小鼠和人类睾丸中的延长精子细胞中共定位（图2G），表明HABP4在组蛋白-鱼精蛋白转换期间的染色质重塑过程中发挥作用。此外，在精母细胞和精子细胞中观察到DNA链断裂，并被认为是精子发生过程中促进DNA构象变化的机制。

4. X染色体连锁逃逸基因在精子细胞中的时间表达动态

使用空间图谱推断上述参与染色质重塑的基因的时间动力学方法的启发，研究人员试图使用相同的方法来描述精子发生过程中X染色体连锁基因的表达动力学。这些基因的一个亚群可以逃避减数分裂性染色体失活（meiotic sex chromosome inactivation ，MSCI）。沿着精子发生的时间轴排列Slide-seq珠，能够区分精子细胞特异性X染色体连锁逃逸基因和MSCI基因。这些逃逸基因包括之前注释的逃逸基因。它们的重新激活依赖于RNF8和SCML2介导的机制。

此外，数据表明，某些X连锁逃逸基因在精子细胞发育过程中表现出3种不同的时间表达模式：第一种模式显示在减数分裂后精细胞（spermatids，RS）中表达峰值，第二种表达模式仅在延长精子细胞发育的早期阶段表达上调，而第三种表达模式的基因在延长精子细胞的整个发育过程中表达上调。这些X连锁逃逸基因重新激活的时间不同，表明它们在调节精子细胞发育方面可能存在功能差异。

5. 识别Leydig细胞和巨噬细胞的阶段特异性表达模式

研究人员使用空间转录组图谱对Leydig细胞和巨噬细胞进行差异表达分析。首先分别在I~III、IV~VI和VII~VIII阶段簇中确定了Leydig细胞的阶段特异性基因（图3A）。其中3个基因（Ankar、Tekt2和Pdilt）此前曾被报道在Leydig细胞中呈阶段性表达。为了进一步验证结果，研究人员使用smFISH来确认IV~VI期相关Leydig细胞中1700017N19Rik的阶段特异性（图3B，单向方差分析，P<10^-4），发现表达1700017N19Rik的Leydig细胞优先定位在管周间隙附近（图3B），其稀疏性和空间定位与睾丸间质干细胞相似。研究人员发现表达1700017N19Rik的Leydig细胞中98.48%±0.03%（mean±SD，n=3）也表达睾丸间质干细胞标记物Nr2f2，表明1700017N19Rik可能参与Leydig干细胞功能的调节。

与对Leydig细胞进行的分析类似，研究人员对巨噬细胞群进行了差异表达分析（图3C），然后使用smFISH确认Efcab6的阶段特异性表达模式（图3D）。最近的研究发现了来自两个不同谱系的两个巨噬细胞群，其中一个位于间质空间，另一个位于管周空间。研究人员发现被指定为管周巨噬细胞的珠子只表达H2-Ab1和Il1b基因，这与之前的发现一致，即这两个基因是管周巨噬细胞的标记基因。

总之，研究人员证明了生精上皮的周期如何影响Leydig细胞和巨噬细胞的分子组成，且成功地根据睾丸巨噬细胞的空间定位区分了这两个谱系。

图3 Leydig细胞和巨噬细胞的阶段性基因表达模式

6. 原位RNA测序对精原细胞微环境进行空间分析

精原细胞（spermatogonia，SPG）包含干细胞群，SPG的自我更新和分化受其周围微环境的影响。为了系统地描述精原细胞微环境，研究人员首先在小鼠（图4A）和人类（图4E）睾丸中绘制了未分化和分化SPG的空间分布图。使用基于KNN的方法（图4B），计算了每个SPG周围微环境的细胞组成，发现在小鼠和人类睾丸中，未分化和分化的SPG在空间上同类之间接近，彼此之间分离（图4B和4F）。

为了对精原细胞微环境进行基于显微镜的测量，研究人员在小鼠睾丸中同时对22个基因进行原位RNA测序，其中有12个细胞类型特异性标记基因（图4C）。该独立数据集进一步支持了Slide-Seq数据的发现（图4D）。非SPG细胞类型的相似空间组成促使研究人员分析两个SPG微环境中的非SPG细胞类型是否处于不同的细胞状态。为此，设计了一种差异表达测试，该测试没有产生显著差异表达基因，这表明围绕未分化和分化SPG的非SPG细胞处于类似的转录状态。总之，数据表明，在小鼠精原细胞微环境中，空间分离的精原细胞亚群暴露于似乎均匀分布的细胞外信号。

令人惊讶的是，与小鼠相比，研究人员发现人类未分化和分化SPG周围微环境的空间细胞组成存在显著差异（图4F），表明这些体细胞类型在形成人类睾丸精原细胞微环境方面可能发挥不同的作用。研究人员使用复合smFISH证实了这一发现，显示了内皮细胞在人类未分化和分化SPG周围微环境中的差异富集（图4G）。

总之，上述数据揭示了小鼠和人类精原细胞微环境的空间结构存在显著差异，表明这两个物种之间控制精子发生早期阶段的不同调节机制。

图4 小鼠与人类睾丸中不同的干细胞微环境

7. 糖尿病通过破坏曲细精管的空间结构而导致睾丸损伤

Slide-seq工作流程和伴随的计算管道也可以用于分析精子发生中的病理变化。为此，研究人员从3只糖尿病小鼠（ob/ob）和3只匹配的野生型（WT）小鼠（图5A）生成了Slide-seq数据。糖尿病（diabetes mellitus，DM）的一个重要并发症是男性生殖系统的紊乱。研究人员试图在空间上定位已识别差异表达基因的表达，发现一些差异表达基因，在ob/ob睾丸横截面中显示出空间表达模式的改变。通过放大单个曲精细管，研究人员发现Smcp的空间表达模式在ob/ob曲精细管中被破坏（图5B）。由于研究人员已经证明Smcp的空间表达模式不是阶段依赖性的，这种破坏不太可能是由于生精上皮周期的不同阶段造成的。对ob/ob小管的仔细检查表明，基因表达模式的改变部分是由于空间细胞组织的改变，尤其是在精子细胞群中。

为了系统和定量地描述ob/ob曲精细管中的这种变化，研究人员首先设计了一种称为纯度评分的指标，以评估ES珠与其他细胞类型珠之间的空间混合程度。在WT生精管中，ES珠聚集在中心，显示出较高的平均纯度分数（图5C）。相反，这种空间组织在ob/ob曲细精管中被破坏，其中ES珠更可能与其他细胞类型的珠进行空间接触，显示出低纯度分数（图5C）。然后，计算了三个重复中72个WT小管和136个ob/ob小管的平均纯度分数，发现ob/ob小管的分数显著低于WT小管（图5D）。

接下来，研究人员通过计算曲细精管内所有细胞类型的成对空间接触频率，量化了它们的空间排列。基于成对空间接触频率的WT曲细精管主成分（PC）分析显示出两个主要簇（图5E）。这两个簇的分离主要是由于生精上皮细胞周期不同阶段的细胞类型比例不同（图5E）。然后，研究人员将ob/ob曲细精管与WT小管聚集在同一PC空间（图5E）。通过比较同一簇下WT和ob/ob曲细精管之间的每对空间接触频率，研究人员有效地消除了小管阶段对细胞类型比例的影响。与纯度评分测量一致，研究人员观察到ES珠和所有其他细胞类型珠之间的空间排列发生显著变化（图5F）。此外，在ob/ob小管中，RSs与其他细胞类型，尤其是巨噬细胞之间的空间接触也显著增强（图5F），这表明在糖尿病条件下，精子细胞的空间排列最容易受到破坏性影响。

综上所述，曲细精管空间结构的破坏是糖尿病导致睾丸损伤的潜在机制。

图5 糖尿病导致曲细精管内睾丸细胞类型的空间排列紊乱

总结

在小鼠和人类睾丸中，睾丸细胞在曲细精管内和周围以特定空间组织支持精子发生。研究人员分别在空间上构建了小鼠和人类曲细精管中未分化和分化的精原细胞细胞图谱，微环境分析确定了小鼠和人类睾丸之间未分化和分化精原细胞周围细胞组成模式的主要差异。此外，研究人员还系统地比较了野生型和糖尿病小鼠睾丸曲细精管之间的空间细胞结构，确定了曲细精管的空间细胞组织的破坏可能是糖尿病损害雄性生育能力的一种机制。

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