单细胞分辨率下的植物组织结构 | 时空简讯23期
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时空简讯第23期。
与动物组织相比，植物细胞包含细胞壁、液泡和叶绿体等结构，组成更为复杂，在对其研究时面临独特的挑战。近年来，单细胞测序技术和空间组学技术的快速发展，助力植物相关领域研究不断取得新的突破。本期就植物根系和叶片结构、相关分析技术方面遴选9篇优质文章，并重点推介以下2篇文章：植物单细胞转录组数据库，关于从植物组织中脱离细胞壁、分离单细胞并保持细胞及其含量完整和位置信息的新技术，供了解参考。
数据库
Database
植物单细胞转录组数据库（PsctH）
Plant Biotechnology Journal [IF: 9.803]
① 整合植物单细胞转录组Marker基因，为植物组织细胞类型提供全面准确的Marker基因资源，数据库链接：http://jinlab.hzau.edu.cn/PsctH/。
② 细胞悬液制备和细胞簇注释仍是单细胞研究面临的两个主要挑战。植物单细胞研究处于起步阶段，且现有资源相当有限，该网站收集来自不同物种不同组织的单细胞测序数据，有助于构建更完整的植物单细胞图谱。
③ PsctH主要内容：可行有效的单细胞原生质体制备流程示意图，包括样本分离、酶消化、纯化和单细胞完整性的检测等；收集了已通过RNA原位杂交或GFP报告基因表达验证过的植物单细胞Marker基因，包含20多个已发表文献中5种植物（拟南芥、玉米、水稻、番茄和花生）的9种组织中的51种细胞类型98个细胞标记。
④ 描述了植物单细胞转录组数据分析流程，包括数据质控、归一化、降维、聚类、标记基因鉴定等。收集了所有已发表的植物单细胞高通量测序数据，建立测序原始数据库，还提供植物单细胞文献挖掘和数据分享平台、数据资源下载服务。网站承诺将继续跟踪单细胞测序研究，并会频繁更新植物细胞Marker基因数据库。（Yuki）
PsctH数据库概述
Plant Single Cell Transcriptome Hub (PsctH): An integrated online tool to explore the plant single-cell transcriptome landscape.
2021.10.26. DOI: 10.1111/pbi.13725
研究文章；植物，单细胞转录组，Marker基因，数据库，scRNA-seq工作流程，数据挖掘；Zhongping Xu, Fang Ding, Shuangxia Jin; 华中农业大学；中国
植物根系结构
Root Structure of Plant
水稻根系的单细胞转录图谱
Molecular Plant[IF: 13.164]
① 选取单子叶植物水稻两个品种粳稻Nip和籼稻93-11的根尖区域（5 mm），应用scRNA-seq，分别获得10,968、12,564个细胞转录组，首次构建了单细胞分辨率下的水稻根系转录图谱。
② 通过鉴定一组新型的水稻特异性标记基因，并用原位杂交和报告基因实验验证，鉴定了8种主要的细胞类型：皮质、内皮层、表皮、表皮（近根毛）、后生木质部、根冠、根毛和中柱。
③ 基于基因的表达模式，不同细胞类型进行相关性分析，发现细胞类型的同源性很高，体现了两品种水稻间具有高度的保守性，其中，品种特异性基因主要在根冠细胞中高表达。
④ 基于scRNA-seq数据，利用拟时序分析，发现表皮细胞分化为根毛细胞和分化的表皮细胞，且两个品种具有保守的发育轨迹。此外，在不同分支间发现了534个差异表达基因，分为3个簇，具有不同的基因表达模式，反映在根发育过程中转录组重新布局。
⑤ 对水稻和拟南芥的数据集进行了相关性分析，发现拟南芥皮质细胞与水稻的部分皮质细胞相关性高，反映了二者在皮质部分的功能保守性，但二者在表皮、内皮、中柱和根冠细胞上的分歧较大。其中水稻和拟南芥的差异基因主要是编码膜蛋白和离子泵的家族，可能与二者的细胞功能、根系形态分化相关。（寒鹤）
水稻scRNA-seq和聚类注释的工作流程
Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.
2020.12.19，DOI：10.1016/j.molp.2020.12.014
研究文章；（植物）生命结构；水稻，根系，转录图谱，发育轨迹，scRNA-seq；Qing Liu, Zhe Liang, Dan Feng, Sanjie Jiang, Jan U. Lohmann, Xiaofeng Gu；中国农业科学院生物技术研究所，深圳华大生命科学研究院，Centre for Organismal Studies, Heidelberg University；中国，Germany.
拟南芥侧根发生中的单细胞转录组图谱
The Plant Cell [IF: 11.277]
① 选取无弯曲、弯曲生长8 h和20 h的拟南芥侧根同一区域的切片，进行显微解剖后生成原生质体，采用单细胞转录组测序，得到6,658个细胞（其中1,730个细胞来自弯曲生长20 h拟南芥，2,443个细胞来自弯曲生长8 h拟南芥，2,485个细胞来自无弯曲对照组），Monocle 3分析得到4个细胞群（皮质和内皮层细胞、小柱/根帽细胞、表皮细胞、中柱细胞），成功地捕获了拟南芥中起始侧根原基（lateral root primordia，LRP）的转录组，并发现了许多与这一过程相关的上调基因。
② 通过拟时间分析，发现木质部尖端中柱鞘（xylem pole pericycle，XXP）细胞是成熟中柱鞘细胞和LRP细胞的前体。
③ 开发了一种选择性抑制侧根起源的XXP中靶基因转录的方法——CRISPR/dCas9工具，该工具与传统的基因敲除相比，多个靶点可以同时抑制同一基因家族中可能具有冗余功能的多个基因，应用CRISPR/dCas9证明了这些靶基因的表达是正常根发育所必需的。
④ 最初被归类为成熟中柱鞘的细胞可能应更准确地描述为LRP侧翼中柱鞘细胞，它的命运是由新根的发生特异性诱导的；内胚层细胞中有一类亚群称为侧根响应内胚层（lateral root-responding endodermis，LRE；276个细胞），这类亚细胞群可以响应重力刺激、磷酸盐缺乏以及调控细胞内生长素平衡，突出了这种命运转变所需的跨细胞排列（cell files）的协调。（陈海霞）
研究设计示意图
A single-cell view of the transcriptome during lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.
2021.04.03，DOI:10.1093/plcell/koab101
研究文章；（植物）生命结构；拟南芥，根，scRNA-seq；Hardik P Gala, Amy Lanctot, Ken Jean-Baptiste, Josh T Cuperus, Jennifer L Nemhauser; University of Washington; USA.
高通量单细胞转录组学技术解析拟南芥根系细胞类型
Cell Reports [IF: 9.423]
① 从生长5、7 d的拟南芥幼苗全根中分离出原生质体，利用Drop-seq生成10个文库：3个文库来自含1%蔗糖下生长的全根，7个文库来自不含蔗糖生长的全根，共获得了12,198个单个根细胞的转录组，其中6,102个细胞来自含蔗糖生长的全根，6,096个细胞来自无蔗糖生长的全根。
② 基于无监督聚类分析，将所有单细胞分为17个簇，根据标记基因鉴定出主要的根细胞类型：中柱、根毛细胞、非根毛细胞、皮质、内皮层、小柱。
③ 基于拟南芥全根的单细胞转录组数据，筛选出一批新的标记基因，如内胚层特异基因（CASP1~CASP5）、根毛特异基因（ADF8），鉴定出的标记基因有助于探索根细胞类型规范和功能的转录过程。
④ 进一步分析发现，鉴别的根所有细胞簇中均包含添加蔗糖和不添加蔗糖生长条件下的根细胞，但细胞类型比例存在显著差异，表明蔗糖会改变细胞类型的比例，但不会改变细胞身份。
⑤ 对内胚层细胞进行拟时序分析，确定了内胚层分化早、中、晚期的共计798个动态表达的基因，其中，早期表达基因调节内胚层分化的初始阶段，中期表达基因与细胞连接组装和木质素代谢相关，晚期表达基因调节成熟内胚层的分化。（寒鹤）
scRNA-seq捕获的拟南芥根的不同细胞类型
High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.
2019.05.14，DOI：10.1016/j.celrep.2019.04.054
研究文章；（植物）生命结构；拟南芥，根，细胞类型，内皮层，蔗糖，发育轨迹，scRNA-seq; Christine N. Shulse, Diane E. Dickel; Department of Energy Joint Genome Institute, Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; USA.
植物叶片结构
Leaf Structure of Plant
拟南芥叶维管组织韧皮部的单细胞转录组图谱研究
The Plant Cell [IF: 11.277]
① 用优化的方法富集维管组织和分离原生质体，scRNA-seq获得5,230个单细胞转录组，聚类鉴定出19种细胞类型，包括表皮细胞、保卫细胞、排水器（hydathodes）、叶肉细胞和所有维管细胞类型，绘制了拟南芥叶片维管组织的单细胞转录组图谱。
② 韧皮部薄壁组织（phloem parenchyma，PP）被分成两个簇，一个富集钙质沉积相关基因，另一个富集光合作用活性相关基因，推测两个簇空间上存在发育轨迹差异。PP组成的亚群富集了转运体：富集编码蔗糖转运蛋白的SWEET家族和氨基酸转运蛋白UmamiT家族。
③ 单细胞转录组图谱中PP和伴生细胞（companion cells，CC）明显分离，且负责韧皮部分化的转录因子APL的突变体中CC标记物急剧减少，而PP标记正常表达，表明APL可能不调控PP的形成，推测PP和CC存在不同的分化途径。
④ CC和PP氨基酸生物合成降解和转运途径存在显著差异，推测PP簇中有部分细胞富含葡萄糖苷，这类细胞具有保护维管系统免受食草动物和病原体侵害的功能，且在PP中检测到较高活性的激素合成代谢。此外，还发现胞间连丝蛋白在不同的细胞类型中表现出不同的表达特性。（Yuki）
拟南芥叶韧皮部物质运输示意图
Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single cell transcriptomics.
2021.05.05, DOI: 10.1093/plcell/koaa060
研究文章；（植物）生命结构；拟南芥，叶，维管组织，韧皮部薄壁组织，scRNA-seq; Ji-Yun Kim, Wolf B. Frommer; Institute for Molecular Physiology and Cluster of Excellence on Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine-University Düsseldorf, Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM), Nagoya University; Germany, Japan.
单异源四倍体花生的单细胞转录图谱和关键转录因子
Plant Biotechnology Journal [IF: 9.803]
① 取黑暗环境生长一周的花生幼苗叶片，scRNA-seq获得6,815个细胞，可聚类为8个主要细胞簇（栅栏叶肉、海绵叶肉、表皮、原基、束鞘、韧皮部、气孔保卫和薄壁细胞），首次构建了花生叶片的单细胞转录图谱。
② 基于scRNA-seq技术，描述花生叶片细胞发育伪时间轨迹，揭示花生叶肉细胞的发育过程：原基首先发育为薄壁细胞，再发育为栅栏细胞；薄壁细胞具有向海绵和栅栏细胞转化的能力，提出栅状细胞具有能够在花生叶中发育成海绵状组织的概念。
③ 提出了表皮发育的两种假定模式：一种是，由茎尖分生组织（shoot apical meristem，SAM）驱动的原始表皮细胞，在叶片生长过程中，其不断增殖并转变为成熟表皮细胞的一部分；另一种是，原始叶原基在叶片大小扩张过程中直接演化为表皮细胞。
④ 基于酶解法不完全消化，使细胞保持原始形态和细胞壁，使用显微镜分离不同细胞类型，并检查同质细胞群中的基因表达，实现了在细胞群水平验证花生叶片在scRNA-seq的基因表达情况。
⑤ AHL23在花生叶片中参与原始细胞分化为表皮组织的过程，通过收集转基因植物的叶组织，检测植物激素的表达，证实AHL23是植物发育中的正调节因子。（寒鹤）
花生叶片原生质体细胞的分离及其分析流程示意图
Single-cell RNA-seq describes the transcriptome landscape and identifies critical transcription factors in the leaf blade of the allotetraploid peanut (Arachis hypogaea L.)
2021.07.19, DOI: 10.1111/pbi.13656
研究文章；（植物）生命结构；花生，叶片，发育轨迹，调节因子，scRNA-seq; Hao Liu, Dongxiu Hu, Puxuan Du, Xiaoping Chen, Rajeev K Varshney, Yanbin Hong；广东省农业科学院作物研究所，International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (ICRISAT), Food Futures Institute, Murdoch University；中国，India, Australia.
时空技术
Spatial-Temporal Technology
1cell-DGE揭示重编程过程中细胞间互作
Nucleic Acids Research [IF: 16.971]
① 建立了一种运用微毛细管操作从完整的组织中提取活细胞内含物，并保留其位置信息的scRNA-seq技术（single cell-digital gene expression，1cell-DGE），解决了从植物组织中脱离细胞壁、分离单细胞、并保持细胞及其含量完整和位置信息的问题。
② 基于1cell-DGE技术，并用UMI标记技术减少PCR扩增过程中的偏好性，成功鉴定了小立碗藓（Physcomitrella patens）叶片切除后，细胞重编程过程中0 h和24 h的6,382个差异表达基因（differentially expressed genes，DEG），其中2,382个基因在0 h时高度表达，4,000个基因在24 h时高度表达。
③ GO富集分析，揭示了在0 h和24 h共同响应和特异响应的生物学过程；将使用1cell-DGE与使用5'DGE方法鉴定的DEG进行比较，发现两组数据中，分别在0 h和24 h共同高度表达的DEG，这些基因可能适合用作新的细胞态标记，以区分未来的研究中静息和重编程叶细胞。
④ 基于0 h和24 h的转录组数据，分析小立碗藓叶片重编程相关的基因PPCSP1、PPCSP2和PPCYCD在拟时序轨迹上的表达变化，发现叶片细胞间PPCYCD表达有较大差异，揭示了细胞在切口边缘的重编程能力中的异质性。（寒鹤）
Single-cell transcriptome analysis of Physcomitrella leaf cells during reprogramming using microcapillary manipulation.
2019.03.21, DOI: 10.1093/nar/gkz181
研究文章；（植物）时空技术，生命结构；小立碗藓，叶片，细胞间互作基因，重编程， 1cell-DGE，单细胞转录组，空间；Minoru Kubo, Ralf Reski, Mitsuyasu Hasebe; Nara Institute of Science and Technology, National Institute for Basic Biology, The Graduate University for Advanced Studies, University of Freiburg; Japan, Germany.
单细胞转录组学在植物研究中的进展与机遇
Annual Review of Plant Biology [IF: 26.379]
① 概述了单细胞转录组学技术在植物研究中的主要进展，提供了从样本准备到数据分析所有步骤的详细指南，并展望了scRNA-seq技术未来在植物研究的发展应用。
② 鉴于植物具有细胞壁的特性，分离单细胞主要有两种方法：酶降解细胞壁、手动分离法。
③ 分析了单细胞转录组学技术在植物中的应用，总结出基于液滴的单细胞技术、基于3'的线性扩增和测序的CEL-SEQ2，以及生成全长cDNA的Smart-Seq技术，提供了足够的分辨率和测序深度，可在整个数据集中生成整个植物器官的转录组数据集。
④ 总结了单细胞转录组数据分析的工作流程，包括质控、归一化、降维和可视化、细胞注释和验证、数据集的整合，以及单细胞转录组数据特征的识别：轨迹推断、基因调控网络分析。
⑤ 提出单细胞转录组技术在植物应用中的新兴方向，包括对数据集更快、更深层次的挖掘，对转录组、表观基因组、代谢组、蛋白组学等多组学技术的整合分析，开发在所有植物物种中应用scRNA-seq的技术方法，单细胞转录组学技术的实验和分析流程的标准化，数据库的构建。（寒鹤）
植物单细胞转录组学研究的关键事件时间轴
Advances and opportunities of single-cell transcriptomics for plant research.
2021.03.27, DOI: 10.1146/annurev-arplant-081720-010120
综述；植物，scRNA-seq，原生质体，细胞图谱，细胞轨迹，基因调控网络，数据分析；Carolin Seyfferth, Jim Renema; Ghent University, VIB Center for Plant Systems Biology; Belgium.
植物单细胞组学研究技术进展
The Plant Journal [IF: 6.417]
① 介绍了植物单细胞原生质体和细胞核分离的最新技术进展，并概述了用于单细胞基因组和转录组扩增的分子方法，如简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）、多个位移放大器（MDA）、多次退火环状循环扩增技术（MALBAC），基于液滴的方法、SMART-seq2捕获和放大转录本。
② 回顾了单细胞组学方法（单细胞染色质可及性、单细胞表观基因组、单细胞蛋白质组等）在植物研究（如植物发育）中的应用，例如，利用scATAC-seq技术研究拟南芥和玉米的根尖细胞，揭示染色质可及性和基因表达动态之间的联系；利用单细胞水平DNA甲基组研究玉米四分体，发现四分体之间的DNA甲基化状态的差异显著，推测四分体之间存在非同时甲基化重编程过程。
③ 讨论了单细胞技术仍然面临的挑战，指出应进一步对植物原生质体样品制备和分离进行优化，从而减小细胞分离过程中引入的偏差和因细胞壁消化导致的细胞转录组之间的差异，以及应进一步设法解决非模式植物scRNA-seq和snRNA-seq数据分析较模式植物更加困难的境况。（Yuki）
该综述主要内容可视化示意图及过20年在植物、动物和所有其他物种中使用单细胞组学的出版物数量
Advances and applications of single-cell omics technologies in plant research.
2022.04.15, DOI: 10.1111/tpj.15772
综述文章；植物，单细胞，单细胞基因组学，单细胞转录组学，单细胞组学；Yajin Mo, Yuling Jiao；清华大学，北京大学，国家植物基因研究中心，中国科学院种子设计创新研究院遗传与发育生物学研究所；中国
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