Cell Reports | 间充质-上皮相互作用调控小鼠胚胎的胃肠道发育

清华大学生命科学学院陈晔光研究团队，利用单细胞和空间转录组技术，绘制了小鼠胚胎E9.5~E15.5发育期间胃、小肠和大肠的全面时空转录组图谱，揭示了该阶段细胞组成的动态变化及器官内部早期区域化的存在，并揭示了调控关键发育事件和决定细胞命运的间充质-上皮相互作用。该文章在2022年7月12日发表于Cell Reports，以下是文章的详细解读。

文章题目：Mesenchymal-Epithelial Interaction Regulates Gastrointestinal Tract Development in Mouse Embryos

发表时间：2022-07-12

发表期刊：Cell Reports

主要研究团队：清华大学生命科学学院等

影响因子：9.995

DOI：10.1016/j.celrep.2022.111053

研究背景

原肠胚形成后，在小鼠胚胎发育至（embryonic day，E）第8.0天左右，内胚层产生由中胚层衍生的间充质包围的肠管上皮。然后，肠管在E8.5发育形成为前肠、中肠和后肠区域。E9.5~E15.5是胃肠道形态发生的关键时期：胃芽出现在E9.5，胃在E13.5区域化，小肠与大肠在E11.5区分，E14.5绒毛形成。肠管区域化和成熟主要由邻近中胚层的指示信号调控。然而，在胃肠道发育过程中，上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用仍不完全清楚。scRNA-seq能揭示细胞相互作用网络在小鼠肠管中的作用，而一些关键时间点和重要环节尚未涵盖。且目前对人类胚胎的研究尚未涵盖胃肠道发育的关键形态发生事件。因此，小鼠或人类胚胎关键形态发生过程中胃肠道的转录组分析和相互作用网络仍有待进一步深入研究。

研究样本

单细胞转录组分析样本：E9.5的肠管，E10.5的胃、肠组织，E11.5的胃、小肠、大肠，E13.5的胃、小肠近端、小肠远端、大肠，以及E15.5的胃、小肠近端、小肠远端、大肠。

空间转录组分析样本：E13.5、E15.5的胃肠切片。

研究策略

利用单细胞和空间转录组技术，绘制小鼠E9.5~E15.5胃肠发育中单细胞水平空间转录组图谱。结合生物信息学分析及免疫荧光实验验证，在空间水平上系统解析胃肠不同发育时期细胞类型分布。同时，由于间充质细胞占据很大比重且具有极强的异质性，因此研究人员重点关注了间充质细胞与上皮细胞间的相互作用。通过分析信号通路受配体的表达模式，建立了间充质细胞与上皮细胞间的互作网络，推测了驱动前胃发育、胃窦特化、小肠前后端差异出现、小肠绒毛形成及大小肠分离等关键事件的信号通路，并且将互作关系具体到细胞亚群。随后，研究人员筛选得到了一系列生长因子，并基于类器官体外培养系统证实了胚胎组织所具有的可塑性，以及生长因子对于胃肠发育细胞的决定性作用。

研究成果

1. 小鼠胃肠的时空发育图谱

研究人员对小鼠胚胎中14个从E9.5到E15.5的5个时间点的胃肠样本进行scRNA-seq，共捕获到65,460个细胞，平均每个细胞表达4,597个基因；同时对E13.5和E15.5的整个胃肠道进行空间转录组分析（~1,700 spots，~3,500基因/spots；图1A），全面覆盖了胃肠发育的“关键事件”，并以此为基础进行深入探究。scRNA-seq鉴定出了26个细胞类群，包括占比最大的间充质细胞，以及上皮细胞等（图1B、1C）；E13.5和E15.5切片中的大多数spots与已知的细胞类型一致（图1F）。结合空间转录组测序，研究人员勾画了单细胞群的空间位置信息（图1G），鉴定出了一系列新的区域化细胞标志物，并通过Muc2报告基因小鼠模型（图1D）及免疫荧光染色（图1E）进行了验证。

图1 小鼠胃肠的时空发育图谱

2. 上皮-间质细胞协调完成胃肠发育过程

为了研究胃肠道的发育过程，研究人员从scRNA-seq数据集中提取了上皮细胞和间充质细胞，并对每个器官的细胞进行了独立的重新分类。

胃上皮（stomach epithelia，STE）细胞依据Gata4的表达水平可分为高表达（STE1/2/5）、低表达（STE3/6）和不表达亚群（STE4/7/8）（图2A）。值得注意的是，前胃上皮细胞STE4和STE7分别出现在E13.5和E15.5（图2B）。轨迹分析表明，Gata4^low细胞向Gata4^-和Gata^high分支分化（图2C、2D），而在E15.5时基本消失，表明它们是一种中间态细胞，在前胃和后胃形态发生中发挥重要作用。E9.5 STE可分为Gata4^low和Gata4^high细胞（图2B），同时E9.5时存在胃窦祖细胞（STE1），证实了在E9.5时就存在胃肠发育区域化差异分化的祖细胞。

胃间充质（stomach mesenchyme，STM）由12个亚群组成（图2E）。与上皮细胞一样，E9.5 STM已表现出明显的异质性（图2F）。STM1在E11.5出现，其标记物Lox在胃和食管之间的近端区域和边界富集（图2G、2H），提示该亚群可能在前胃形态发生和器官分离中发挥作用。STM表现出两个不同的发育分支，分别来自早期前体（STM2/3/9/11/12）和靶向分支1（STM4/6/7/8/10）、分支2（STM1/5）（图2I）。轨迹分析揭示了细胞的进化路线（图2J、2K）。

总之，以上数据表明，STE和STM从E9.5协调发育到E15.5，细胞亚群发生了显著变化。

图2 发育中胃上皮和间质细胞的分化

小肠上皮（small-intestinal epithelium，SIE）中的细胞聚集成3个亚群，分别代表近端Fabp1^high（SIE1）和Pdx1⁺（SIE4）、远端Osr2⁺（SIE2/3）、部分Tff3⁺分泌祖细胞（SIE5）（图3A）。E9.5时已存在近端和远端的区别（图3B）。轨迹分析揭示了两个发育分支，其中一个是分泌型祖细胞（图3C、3D）。值得注意的是，成人肠干细胞标记物Lgr5在E9.5出现在远端上皮（SIE2/3）中，并且在E13.5时高度富集，这一点经原位杂交得到验证，且Lgr5报告小鼠显示其从近端到远端上皮的表达逐渐增加（图3E）。研究人员用Lgr5-CreERT2;Rosa26-ZsGreen小鼠追踪Lgr5⁺细胞在发育小肠中的细胞命运，发现在E11.5三苯氧胺诱导后，仅能在E15.5追踪到一小部分近端上皮细胞（图3F），这些细胞随机分布在绒毛尖端或相邻绒毛之间的区域，表明Lgr5⁺细胞不是早期的干细胞祖细胞。然而，因为Lgr5⁺细胞在远端富集，大多数远端上皮细胞被追踪到。总之，这些数据表明，Lgr5⁺细胞可能在小肠近端和远端发育过程中发挥不同的作用。

小肠间充质（small-intestinal mesenchyme，SIM）细胞在近端组（SIM3/5/8/9）和远端组（SIM1/2/4/7）之间的也有明显的差异（图3G）。SIM1/3/9/13出现在E10.5~E11.5，SIM1/13靠近盲肠，这表明它们可能参与了盲肠的形态建成及大小肠分隔过程（图3H）。SIM11簇（Foxl1⁺终末细胞）是成人小肠的重要信号资源，在E13.5开始出现（图3H）。伪时间分析揭示了SIM11可能来源于SIM3，表明SIM3可能是端粒细胞的起源（图3I~3K）。

图3 发育中小肠的近端和远端细胞的分化

大肠上皮细胞（large-intestinal epithelial cells，LIE）也可聚集成不同的亚群，包括出现在E15.5（LIE6）的Tff3⁺分泌祖细胞（图4A、4B）。轨迹分析表明，这些细胞经历了3个分化分支（图4C、4D）。大肠间充质（large-intestinal mesenchyme，LIM）也表现出由15个亚群组成的高度异质性（图4F）。在E9.5，LIM1和LIM11是主要亚群，分别在E15.5和E10.5消失（图4G）。有趣的是，在E10.5和E11.5时，包括LIM2/7在内的细胞异质性显著增加（图4G）。Adamdec1⁺LIM7分布于E11.5和E13.5的近端大肠（图4H和4I）。轨迹分析表明，LIM子集有两个主要来源：LIM11和LIM1，前者首先产生LIM2/10/14，最后产生LIM7/15，而后者首先产生LIM8/9/13，最后形成LIM3/4/6（图4J~4L）。

图4 大肠发育过程中的细胞异质性

3. 动态的间充质上皮相互作用调控胃肠的关键发育事件

考虑到间充质细胞占据很大比重，且上皮细胞亚群和间充质细胞亚群之间的相互作用是复杂的，研究人员将重点放在驱动这三个器官（胃、小肠、大肠）关键发育事件的相互作用上。

重点分析了前胃和胃窦特异形成的过程。通过分析了Gata4^low上皮细胞（STE3/6）接收到的信号，发现STM1可以通过NRG（神经调节蛋白）和BMP信号影响STE3/6；Hh、成纤维细胞生长因子（fifibroblast growth factor，FGF）和生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）信号可能参与STE3/6进化的自分泌调节（图5A）。STM1出现在E11.5（图2F），即STE4/7出现之前的时间，暗示其在前胃形态发生中的重要性。该子集源自STM3（图2I-2K），STM3接收来自其他STM、STE和自身的信号。这些信号可能参与STM3产生STM1和随后的前胃形态发生（图5A）。对于胃窦形成，祖细胞（Pdx1⁺ STE1）的形成可能受到多种间充质衍生信号的调节，如CXCL、NRG和多肽，以及自分泌BMP、GDF、FGF和Hh（图5B）。因此，这些信号可能在后期的胃窦形态发生中起作用。

研究人员分析了小肠的关键发育事件，包括近端和远端分化和绒毛的形成。间充质-上皮相互作用可能导致近端和远端分化，从而为十二指肠、空肠和回肠的分割奠定基础。近端（SIE1/4）和远端（SIE2）上皮接收到的不同信号可能在近端和远端分化中起作用。间充质衍生NRG、CXCL和能量稳态相关（ENHO）信号可能作用于近端部分的SIE1/4，而转化生长因子b（TGF-b）、BMP和骨钙素信号可能作用在远端部分的SIE2（图5C）。还检测到自分泌信号，如SIE2中的细胞粘附分子、Notch、vitronectin（VTN）和Wnt。在肠绒毛形成方面，SIM11是E13.5的子集，来源于E11.5的SIM3和高表达的Pdgfra（图3H、3K），可能是绒毛尖端参与绒毛形成的细胞。SIM3可以从SIM6/8/12/13/14接收ncWnt、Periostin和EDN（内皮素）信号，Hh、血小板衍生生长因子（PDGF）和来自SIE1/4的FGF信号，以及自分泌PDGF（图5D），表明组合信号事件在SIM3到SIM11进化中的作用。在大肠中，研究人员主要关注小肠和大肠之间的分割。上述数据表明，SIM1/13和LIM2/7可能在此事件中发挥作用，在此期间SIM1/13可能受到IGF、Kit、ncWnt和Notch的影响，而SIE2可能从SIM1/13接收TGF-b、Wnt和Periostin信号（图5E）。LIM2/7可以接收FGF、PGDF、Hh和PTN信号，并通过BMP、ncWnt、Wnt和PTN影响LIE1/2。

随后研究人员通过单细胞数据及空间数据分析了这些细胞类型的空间分布（图5F、5G），大多数间充质亚群显示出区域分布，如上文所述，STM1位于近端胃，SIM3位于近端小肠，LIM7位于近端大肠。E13.5中STM1的增加可通过分泌TGF-b、BMP、ncWnt和胰岛素样生长因子（IGF）促进前胃（Gata4^-）的形态发生（图5H）。SIM5可能是BMP、ncWnt、IGF和Notch调控小肠近端的SIE1/4的来源。

研究人员研究了在胃肠发育分化中发挥作用的细胞因子，如小肠远端的SIM2可通过分泌BMP和ncWnt影响SIE2/3。E13.5时出现的SIM11端粒细胞分泌TGF-b、BMP、NRG、FGF和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）。由于HGF在SIM11端粒细胞中高度表达，可能影响小肠上皮细胞（图5I），研究人员通过用HGF处理E15.5小肠类器官来探索HGF的作用，证实HGF因子可作用于上皮细胞并引起其形态学变化，并引起Muc2和Chga高表达（图5J），提示HGF可能在细胞命运决定中发挥作用。

图5 上皮-间充质细胞之间的动态信号相互作用调控胃肠的关键发育事件

4. 肠道类器官中生态位因子对细胞命运的决定作用

为了探讨生态位因子在调节胃肠道早期发育中的重要性，研究人员建立了E9.5肠管的类器官体外培养系统，并分别检测了FGF10和视黄酸（retinoic acid，RA）在前肠和后肠中的功能。在基础培养条件下，E9.5前肠或后肠衍生出的类器官可以维持生长，但都经历了前肠（Sox2）和后肠（Cdx2）的命运；添加FGF10将细胞命运推到前肠，而RA和FGF4共同作用有利于后肠命运。大量RNA-seq分析显示，前肠和后肠衍生的类器官都忠实地保持了各自的标记表达。然后，研究人员测试了生态位因子是否可以通过将RA和FGF4添加到前肠类器官或后肠类器官中的FGF10来改变细胞命运（图6A）。经过4代（约10 d），发现前肠类器官获得了RA和FGF4的后肠特征，后肠类器官获得了FGF10的前肠特征，表现为差异表达的标记基因（图6C~6F）。上述数据表明，间充质来源的生态位信号在调控上皮细胞命运的决定中起着关键作用，也突出了E9.5肠管上皮细胞的细胞可塑性。最后，研究人员进一步筛选出后肠间充质富集的一系列生长因子，如Bmp5、Dlk1、Rarres2、Postn等，并将这些生长因子添加到培养的后胃衍生的类器官中（图6G），发现这些生长因子能够促进后肠类器官的发育。

图6 肠道类器官中生态位因子对细胞命运的决定作用

结论

该研究建立了小鼠胚胎E9.5~E15.5胃肠发育的单细胞转录组图谱，通过整合空间转录组，追踪了发育胃肠道中上皮细胞和间充质细胞的进化过程，以及它们之间的空间相互作用。此外，该研究还揭示了在E9.5时，上皮细胞和间充质细胞中都存在区域异质性，以及间充质细胞在调控上皮细胞的区域化和细胞命运决定中的关键作用，极大完善了对胚胎胃肠道发育的认识。

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